花生转基因的方法

摘要

本发明公开了一种花生转基因的方法，其步骤是首先建立花生的重复体细胞胚发生培养物；其次是将外源DNA或基因构建在植物表达框或表达载体中，抽提、纯化和确定外源DNA的浓度；第三是微粒轰击转化重复体细胞胚发生培养物和筛选独立抗性细胞系；第四是再生植株和传代；第五是转基因植株和转基因后代分子分析。本发明采用保存0-6年的成熟花生种子诱导的，启始培养后1-10个月的重复体细胞胚发生培养物为转基因受体；转基因效率高，转化通量高；轰击后筛选效率高，无逃逸，无嵌合体；整个过程不存在基因型依赖，且再生植株高效容易，可大量获得转基因后代种子，且外源基因可稳定整合、表达遗传。

主权项

一种花生转基因的方法，它包括下列步骤：A、建立花生的重复体细胞胚发生培养物：贮藏0‑6年花生的成熟荚去壳，种仁乙醇表面消毒，然后NaOCl消毒，重蒸馏水3‑5次漂洗，无菌条件下去掉种皮，成熟胚胚轴上部接种于含生长素的体胚发生培养基，即：MS盐，B5维生素，3％蔗糖，3mg/L picloram和0.8％琼脂，调pH5.8，121℃灭菌15分钟后，温度控制在55‑60℃时补充过滤灭菌的1g/L谷氨酰胺，28℃黑暗培养20‑30天，每2‑4周转移体胚和胚性愈伤到新体胚发生培养基中继代培养1‑10个月获得重复体细胞胚发生培养物；B、外源DNA或基因构建在植物表达框中并在同一或不同载体上，抽提、纯化外源基因植物表达框或载体和确定其浓度：待转化的外源DNA是筛选标记基因和目的基因，筛选标记基因为植物表达载体携带的潮霉素抗性、草铵膦抗性、草甘膦抗性筛选标记基因植物表达框，植物表达载体为pCAMBIA系列和pRT系列，待转化的外源目的基因为植物病原菌抗性基因、作物品质和产量相关基因，为人Bc1‑x1基因；拟南芥RRS1‑R基因；花生FAD2基因；花生Ara h基因，在植物表达载体上构建目的基因植物表达框，目的基因与筛选标记基因植物表达框可连一起，即构建到同一植物表达载体上；目的基因与筛选标记基因植物表达框分别处于不同植物表达载体上或DNA片段中，外源基因的植物表达框或载体构建、质粒或DNA片段的抽提、纯化和确定浓度；C、微粒轰击转化重复体细胞胚发生培养物和筛选独立抗性细胞系：放置重复体胚发生胚性组织在体胚发生培养基中，准备金微粒悬浮液，金微粒悬浮与含筛选基因和非筛选目的基因的质粒或DNA片段混合，震荡中依次加入氯化钙和亚精胺，震荡悬浮，离心，乙醇漂洗包裹质粒的金微粒，乙醇重悬微粒，重悬微粒滴于金微粒载片，轰击，被轰击的胚性组织转入含致死浓度筛选剂培养基，在1个月筛选后，分离独立的抗性细胞系，各系组织直接地继代培养于新鲜的含致死浓度筛选剂的半固体体胚发生培养基中筛选，存活增殖、抗性被证实的独立系获得抗性细胞系系号，在筛选之下继代培养增殖抗性细胞系，增殖体胚用于植株再生；D、再生植株和传代：抗性细胞系体胚在含植物调节物质的培养基中26℃黑暗成熟，体胚转移入含细胞分裂素的培养基中，经培养基操作过程1TDZ或3B1G，在16/8小时光周期光照培养萌芽，切下2cm长的芽于含生长素的培养基生根，生根的小植株移入花土中，最后转移到温室，栽培管理，收获T1代合子，对T1代种子系继续传代选育，所述的培养基操作过程1TDZ是通过含4.9μM噻二唑苯基MS培养基培育，促使体胚转换；所述的培养基操作过程3B1G是转到基础培养基加13.31μM BA和2.89μM GA培养基中促体胚转换；E、转基因植株和转基因后代分子分析，分子分析抗性细胞系、再生植株和种子：从B、C、D步骤中的抗性细胞系、再生植株和种子的愈伤、再生植株叶、种子子叶提取DNA或RNA或蛋白质，确定目的基因和筛选基因整合，确定外源基因在抗性细胞系、再生植株和种子的稳定整合转化性和转化事件独立性，确定目的基因的表达水平、稳定性和传代遗传。