一种人分化抑制因子3表达载体、融合蛋白及其制备方法

摘要

本发明属于基因工程和医学生物领域，公开了一种人分化抑制因子3表达载体、融合蛋白及其制备方法。该表达载体是将PCR扩增后的hId3基因克隆于融合表达载体pET32a的EcoR I和Sal I位点之间，得到重组表达载体hId3/pET32a。本发明将hId3编码基因定向克隆到原核表达载体，获得hId3融合蛋白表达载体，实现了hId3在大肠埃希菌中的高效表达，表达量占菌体总蛋白的27％，同时提供了一整套工程菌诱导表达和纯化工艺，并以hId3融合蛋白为免疫原制备兔抗hId3多克隆抗体，为进一步研究hId3蛋白的生物学功能及其在临床医学诊断中的应用奠定基础。

主权项

一种抗hId3多克隆抗体，其特征在于它是兔源性的多克隆抗体，是通过下列方法制备得到的：用凝血酶切割融合蛋白Trx‑His‑hId3，用Ni‑NTA亲和层析柱再次分离，获得切下Trx‑His的hId3蛋白，以此蛋白为抗原作为免疫抗原，免疫具有免疫活性的8周龄新西兰雄兔，背部皮下分多点注射；首次免疫时，用纯化的重组蛋白1mg与1ml弗氏完全佐剂充分乳化，于每只兔子背部皮内注射；15天后，加强免疫，剂量同上但用弗氏不完全佐剂，注射于背部皮下；两周后使用加强免疫的方法再次加强免疫；第二次加强免疫10天后，开始取耳缘静脉采血检测抗体效价，用琼脂糖单向扩散试验测得兔源性抗血清的效价，收集抗血清，分装，于‑70℃冻存；其中，融合蛋白Trx‑His‑hId3采用下列方法制备得到：构建的重组表达载体：将PCR扩增后的hId3基因克隆于融合表达载体pET32a的EcoR I和Sal I位点之间，得到重组表达载体hId3/pET32a，其中hId3基因上游融合了6个组氨酸和硫氧还原蛋白基因片段，利用His标签与Ni离子的亲和作用，融合表达出的蛋白产物用Ni‑NAT树脂进一步纯化，hId3与Trx的融合表达增加表达产物的可溶性，携带Trx‑His‑hId3融合基因的hId3/pET32a处于pET32a的T7启动子控制之下，融合蛋白基因中的外源蛋白基因与Trx之间还具有肠激酶和凝血酶的识别位点，便于从融合蛋白中切下Trx；用所构建的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，在37℃进行基础培养，当细菌密度OD600值为0.4～0.6时，37℃表达3～4小时；收集表达细胞，悬浮于含20mM Tris‑HCl，pH 7.9，500mM NaCl，10mM β‑巯基乙醇，1mmol/L PMSF的1×Binding Buffer，超声破碎细胞，经离心后，取上清液用于Ni‑NTA亲和层析柱分离纯化，获得融合蛋白Trx‑His‑hId3。