磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法

摘要

本发明属于生物工程领域，涉及一种磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，其技术方案是将工程菌发酵离心后粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、SP-Sepharose HP离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层析等步骤纯化获得磷脂酰丝氨酸合成酶。本发明制备磷脂酰丝氨酸合成酶具有制备工艺简单、酶活力高等优点，适合工业化生产；并且由磷脂酰丝氨酸合成酶催化卵磷脂和丝氨酸合成的磷脂酰丝氨酸，在医药、食品及保健品领域具有良好的应用前景。

主权项

一种磷脂酰丝氨酸合成酶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1).制备粗发酵液将工程菌接种至LB液体培养基中，36～38℃振荡培养10～14h，培养后产物按3～7％的接种量转接至相同培养基中继续培养2～3h，然后加入10～20％的蔗糖水溶液，诱导26～30h，诱导后产物在3～5℃、8000r/min的条件下离心15～25min，收集上清，制得粗发酵液；(2).盐析粗发酵液在3～5℃、8000r/min的条件下离心15～25min，收集上清，加入硫酸铵至75％饱和度，3～5℃静置10～14h后，在3～5℃、8000r/min的条件下离心15～25min，倾去上清，沉淀溶于pH 7.0、10mM的Tris‑HCl缓冲液中；(3).脱盐将第(2)步的产物采用截流分子量为10kDa～20kDa的中空纤维膜进行超滤浓缩；(4).SP‑Sepharose HP离子交换层析采用pH 7.0、10mM的Tris‑HCl缓冲液平衡层析柱，将脱盐后的活性组分用同样的缓冲液溶解，8000r/min离心15～25min，取上清，上样1～3mL后先用该缓冲液洗脱未吸附的蛋白，再用含0～1mol/L NaCl的该缓冲液进行梯度洗脱，收集活性组分；(5).Sephadex G‑75凝胶层析离子交换层析得到的活性组分，先用含1.0％NaCl的Tris‑HCl缓冲液溶解，8000r/min离心15～25min，取上清，上样1～3mL后用相同缓冲液进行洗脱，收集的活性组分即为磷脂酰丝氨酸合成酶，所述的工程菌是保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.1395的枯草芽孢杆菌。