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Método para detectar la presencia o la ausencia de una secuencia de ADN mutante en una muestra, comprendiendo el método las etapas de: a) poner en contacto a la muestra con un sistema de oligonucleótidos en condiciones de hibridación para formar una mezcla de reacción, incluyendo dicho sistema de oligonucleótidos un cebador inverso y un cebador mutágeno, en el que i) dicho cebador inverso incluye: - una región del extremo 5' que comprende una secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por una endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura; teniendo dicha región del extremo 5' unido covalentemente en sus extremos un sistema de detección acoplado, de modo que, cuando la secuencia de reconocimiento es escindida por dicha endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura, se genera una señal; - una región del extremo 3' capaz de hibridar con una región complementaria cadena abajo de la supuesta secuencia de ADN mutante; ii) dicho cebador mutágeno comprende: - una región del extremo 5' que comprende una primera secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por una endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura; - una región del extremo 3' capaz de hibridar con una región complementaria del extremo opuesto de la otra cadena de la secuencia de ADN de muestra, dicho cebador mutágeno tiene una secuencia de modo que se crea una segunda secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura, solamente cuando dicho cebador se extiende en la secuencia de tipo silvestre de modo que la endonucleasa de restricción digiere el amplicón y suprime la reacción de amplificación; y dicha segunda secuencia de reconocimiento que puede ser cortada por endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura no se polimeriza cuando la secuencia mutante está presente en la muestra de ADN; b) añadir con sustratos y cofactores apropiados, en un entorno iónico y de pH adecuado, tanto una ADN polimerasa resistente a temperatura como dicha endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura a dicha mezcla de reacción en condiciones de reacción predeterminadas, tales que, si la secuencia de ADN mutante está presente en la muestra, dicho cebador inverso y dicho cebador mutágeno hibridan con la misma y ceban la reacción de ADN polimerasa para obtener un primer producto amplificado específico; c) ciclar la hibridación de dicho sistema de oligonucleótidos de modo que se extiende un segundo producto amplificado específico que comprende la región del extremo 5' del cebador inverso que forma un sitio de reconocimiento de cadena doble para dicha endonucleasa de restricción de modo que la endonucleasa de restricción resistente a alta temperatura corta específicamente en la secuencia de reconocimiento e induce la generación de una señal por el sistema de detección acoplado; d) detectar la señal generada.
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