一种融合蛋白及其在缺血性脑卒中中的应用

摘要

一种GST-TAT-SOD融合蛋白，是通过融合蛋白发酵液的制备和纯化实施得到的，该融合蛋白可应用于治疗缺血性脑卒中，其使用的剂量范围是50～5000SOD活力单位/Kg体重，其中GST、TAT和SOD三者以肽键连接，肽键连接发生在任何不明显影响SOD活性的部位，治疗缺血性脑卒中产品的给药方式为注射、口服。

主权项

一种融合蛋白，其特征在于：该蛋白为一种GST‑TAT‑SOD融合蛋白，该蛋白的制备方法的具体步骤为：融合蛋白发酵液的制备和纯化：1）融合蛋白GST‑TAT‑SOD 发酵液样品的制备：将构建好的含有GST‑TAT‑SOD基因的菌株接种于50‑150mL 含30‑70ug/mL Amp 的LB 培养基中，37℃摇培过夜；菌液按1‑3％v/v接种量接种于500‑1500mL 新鲜的LB 培养基中，该培养基含30‑80ug/mL Amp，37℃摇培到OD600=0.6－1.0时，分别添加CuSO4200‑800uM、ZnSO450‑150uM和IPTG 至终浓度为125‑500uM，22‑28℃振摇诱导培养5‑7h；收集菌液，5000rpm 离心10‑25min，收集菌体，用100mLPBS 重悬，冰浴中超声破碎30min，12000rpm 离心10min，上清液用0.22um 膜过滤后的发酵液，备用2）融合蛋白GST‑TAT‑SOD纯化方法：亲和层析A.发酵液超声破碎12000rpm，离心20min 后弃去沉淀，重复操作三次，取上清液； B.将上清液加到用 PBS 预平衡的 GST 融合蛋白亲和色谱柱中，轻轻搅拌，使亲和基质与融合蛋白充分混匀，色谱柱放置于冰浴中，自然沉降；C.打开恒流泵，抽干色谱柱的液体；D.加入pH7.4 PBS，平衡十个柱体积，抽干色谱柱的液体；E.加入一倍柱体积的0.01mol/L 谷胱甘肽和0.02mol/L Tris‑HCl 溶液，pH=8.0, 轻轻搅拌使溶液与胶充分混匀，色谱柱放置于冰浴中，自然沉降，打开恒流泵接收洗脱液；F.重复步骤E 两次；G.混合三次亲和胶洗脱液，－20℃保存备用。