禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因频率的高通量分子检测

摘要

本发明属于禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵抗药性基因频率的高通量分子检测方法，可用于小麦赤霉病菌的抗药性监测和抗药性病害流行的早期预警。本发明基于97％以上的禾谷镰孢菌对多菌灵的抗药性基因型属于β2-微管蛋白基因167位点突变的研究基础建立起来的一种抗药性高通量检测技术。该检测方法共分3个主要步骤，(1)分别提取已知敏感和抗药性菌株及待测样品的基因组DNA；(2)进行特异性实时定量PCR反应，建立标准曲线；(3)对照标准曲线求出测定样品中的抗药性基因频率。该方法具有高通量、快速、准确的特点。抗药性基因频率检出灵敏度可达万分之一至十万分之一，准确率达96％以上。

主权项

禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)对多菌灵抗药性基因频率的高通量分子检测方法，其特征在于采用实时定量PCR(Real‑time quantitative PCR)技术检测病样中禾谷镰孢菌群体对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性的基因频率。该检测方法共分三步：(1)采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取已知抗药性菌株、敏感性菌株和待测样品的核基因组DNA。(2)运用引物和设计的特异性Cycling Probe进行实时定量PCR反应，分别建立抗药性菌株和敏感菌株检测的标准曲线。实时定量PCR(Real‑time quantitative PCR)反应体系及其扩增程序：反应体系：10×CycleavePCR Buffer           2.5μLdNTP Mixture(各2.5mM)            3μLMg Solution(25mM)                5μLCodon167F(10μM)                 0.5μLCodon167R(10μM)                 0.5μLP1(5μM)                         0.6μLP2(5μM)                         1μLTliRNase H II(200U/μl)          0.5μLTaKaRa Ex TaqTM HS(5U/μl)       0.25μLDNA模板(敏感和抗性菌株各加入1μL)2.0μLdH2O(灭菌蒸馏水)     补足至总体积25μL                                       扩增条件：预变性：95℃           30s              ↓变性：95℃             5s退火：55℃             20s延伸：72℃             31s40个循环(3)待测样品运用上述体系和条件进行实时定量PCR反应，对照已经建立好的两个标准曲线，求出相应的抗药性菌株和敏感性菌株的数量和抗药性菌株在禾谷镰孢菌总量中的比例。