维持干细胞自我更新的6个猪源关键基因的体外转录质粒的构建

摘要

本发明涉及一种维持干细胞自我更新的6个猪源关键基因的体外转录质粒构建，其特征在于具体制备方法如下：首先设计基因体外转录空载体Vitro-TransPMD-18T，然后获得EGFP和维持干细胞自我更新的猪源的6个关键基因的cDNA，并按相应的酶切位点进行酶切连接，最后用体外转录试剂盒对7个体外转录质粒进行体外转录，得到相应的mRNA，然后将Vitro-Trans-EGFP转染进猪胚胎成纤维细胞：其6个基因体外转录出的mRNA转染进猪胚胎成纤维细胞后能够使其转变成猪的多能干细胞；6个基因体外转录出的mRNA能够高效翻译。

主权项

维持干细胞自我更新的6个猪源关键基因的体外转录质粒的构建，其特征在于具体制备方法如下：首先设计基因体外转录空载体Vitro‑TransPMD‑18T，然后获得EGFP和维持干细胞自我更新的猪源的6个关键基因的cDNA，并按相应的酶切位点进行酶切连接，最后用体外转录试剂盒对7个体外转录质粒进行体外转录，得到相应的mRNA，然后将Vitro‑Trans‑EGFP转染进猪胚胎成纤维细胞：(1)、基因体外转录载体的构建用重叠延伸PCR的方法得到104bp的序列，包括T7启动子，增强翻译效率的minusCT，包含ATG起始密码子的5’UTR和一段包含酶切位点的无关序列；然后连接进入PMD‑18T simple载体，用于以后表达基因的插入；根据目的序列设计2对引物，P1：5′‑tatagggagaagagggagagtagagccgccaccat 3′，P2：5′‑attctccgcggacatatgtgggcccatggtggcgg3′；P3：5′‑Ctcgaggactaatacgactcactataggga 3′，P4：5′‑aagcttgctagctctcgagagaattctccg 3′；用引物P1和P2进行PCR扩增得到60bp的序列，电泳，切胶回收，然后以60bp的产物为模板用引物P3和P4进行PCR，得到104bp的反转录模板序列；Ctcgaggactaatacgactcactatagggagaagagggagagtagagccgccaccatgggcccacatatgtccgcggagaattctctcgagagctagcaagctt；(2)、维持干细胞自我更新的猪源关键基因的cDNA的获得利用NCBI中公布的EGFP的序列和杜洛克猪的相应基因mRNA序列，设计引物，包括：Oct4(NM_001113060.1)，Sox2(NM_001123197.1)，c‑Myc(NM_001005154.1)，Klf4(NM_001031782.1)，Nanog(NM_001129971.1)和Lin28(NM_001123133.1)；引物两端带有连接体外转录载体的内切酶位点(NcoI，EcoRI和NheI)，采用RT‑PCR的方法得到这6个基因的cDNA序列；(3)、基因体外转录质粒的获得将上述的体外转录空载体与Oct4，Sox2，c‑Myc，Klf4，Nanog和Lin28的7个基因的cDNA连接，得到基因的体外转录质粒(VitroTrans‑EGFP/Oct4/Sox2/c‑Myc/Klf4/Nanog/Lin28)；(4)、基因的体外转录利用Applied Biosystems公司的mMESSGE mMACHINE T7Ultra Kit对线性化的基因体外转录质粒进行体外转录；(5)、基因体外转录出的mRNA功能的验证用作为对照的体外转录出的EGFP的mRNA对猪成纤维细胞进行转染，12小时后观察到绿色荧光蛋白表达。