极细枝孢霉生物合成茶黄素粗提物的方法

摘要

一种极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)生物合成茶黄素(Theaflavins，TFs)粗提物的方法，通过对大量微生物进行筛选，获得多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)的高产菌株极细枝孢霉，在优化的发酵培养基中pH为4.5-5.6、摇床转速为110-130r/min、温度为22-25℃的条件下恒温培养该菌株合成多酚氧化酶，取得多酚氧化酶粗酶液，并通入氧气进行体外模拟氧化儿茶素40-50分钟制备茶黄素。应用本发明可以获得茶黄素粗制品中茶黄素含量高于20.00％，且工艺步骤简单，设备投入少，工效高，生产成本低；反应过程中不使用任何有机溶液，是一种绿色环保的茶黄素生产方法。

主权项

一种利用极细枝孢霉产生的多酚氧化酶生物合成茶黄素粗提物的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)、多酚氧化酶粗酶液的制备：a、先培养出极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)CGMCCNO.2891；b、菌种的扩大培养：将a步骤中纯化菌种转接种至每10.0ml的PDA含有0.02g大叶种茶儿茶素的液体培养基中，于22‑25℃下，以转速为110‑130r/min恒温振荡培养4天；c、发酵培养基的配制：配制马铃薯200g/L、葡萄糖5g/L、NH4NO3 3g/L、纯度大于70％的大叶种茶儿茶素3g/L、CuSO4 0.1mmol/L、FeSO4 0.1mmol/L的液体发酵培养基，培养液体积为容器总体积的50‑65％，pH为4.5‑5.6，于121℃条件下灭菌20min；d、菌种的接种与发酵：取b步骤中带有菌株的扩大培养基接种到c步骤中的发酵培养基中，接种量为扩大培养基∶发酵培养基的体积比为4‑7∶93‑96，于22‑25、转速为110‑130r/min恒温振荡培养4天；e、制备粗酶液：取上述发酵培养液，用4层干净纱布过滤菌丝体，然后于3‑5℃下，以离心转速为7800‑8200r/min离25‑35min后，取上清液作为粗酶液；(2)、酶促氧化儿茶素制备茶黄素：取上述粗酶液，按每100ml粗酶液加入纯度大于70％的儿茶素2.0g，于温度为22‑25℃、pH为4.5‑5.6的条件下通入氧气以不产生大量气泡为宜，反应40‑50分钟，将反应液用膜过滤浓缩冷冻干燥即得茶黄素粗制品。