野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法

摘要

野猪α-干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，国内重组菌株或者是表达量不高，或者是产物是以融合状态表达，或者是产物带有纯化标签，或者是没有高密度发酵工艺，存在诸多问题。本发明组成包括：用大肠杆菌偏爱密码子以及密码子对合成了野猪α-干扰素基因，构建高效表达载体并转化高效表达菌株，工程菌高密度发酵、包涵体的分离纯化、目的蛋白的变性、复性和纯化以及表达产物的生物活性测定方法。本发明属于生物制药中的基因工程生产多肽药物技术领域。

主权项

一种野猪α‑干扰素的基因合成和载体构建及产物的生产方法，其组成包括：用大肠杆菌偏爱密码子以及密码子对合成了野猪α‑干扰素基因，构建高效表达载体并转化高效表达菌株，工程菌高密度发酵、包涵体的分离纯化、目的蛋白的变性、复性和纯化以及表达产物的生物活性测定方法，其特征是：所述的人工合成的编码野猪α‑干扰素的基因含有如下核苷酸序列ATG TGT GATCTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG CAC ACC CGT GCG CTG CGT CTG CTG GCG CAGATG CGT CGC ATC AGC CCG TTT AGC TGC CTG GAT CAC CGT CGC GAT TTT GGT TTCCCG CAG GAA GCG CTG GGC GGC AAC CAG GTG CAG AAA GCG CAA GCC ATG GCG CTGGTG CAT GAG ATG CTG CAG CAG ACC TTC CAG CTG TTC AGC ACC GAA GGC AGC GCGGCG GCC TGG GAT GAG AGC CTG CTG CAC CAG TTC TAT ACC GGT CTG GAT CAG CAGCTG CGC GAT CTG GAA GCG TGC GTG ATG CAG GAG GCG GGC CTG GAA GGC ACC CCGCTG CTG GAG GAG GAT AGC ATT CTG GCG GTG CGT AAA TAT TTC CAT CGT CTG ACGCTG TAT CTG CAA GAA AAA AGC TAC AGC CCG TGT GCG TGG GAA ATT GTG CGT GCGGAA GTG ATG CGC GCG TTC AGC AGC AGC ACC AAC CTG CAA GAT CGT CTG CGT AAAAAA GAA TAA，将含有所述的核苷酸序列的野猪α‑干扰素的基因插入到带有pL、pR启动子、Cits温控阻遏蛋白基因的表达载体pWL中，构建成野猪α‑干扰素的基因的表达质粒pWL‑poIFN‑α，转化大肠杆菌DH‑5α后，野猪α‑干扰素获得高效表达，对所述的工程菌进行30℃培养过夜，以10％接种量接种至发酵罐中，诱导表达时机为OD600达到4～10时，42℃诱导发酵培养2.5～5.5小时，包涵体粗提液为50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、0.1毫克/毫升溶菌酶、0.1～0.4％TritonX‑100，包涵体精提液为50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、0.5～2摩尔脲，蛋白变性液为8～10摩尔脲、50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、10毫摩二硫苏糖醇，蛋白复性液为50毫摩tris、1毫摩乙二胺四乙酸、5毫摩还原型谷胱甘肽、1毫摩氧化型谷胱甘肽、10毫摩NaCl，分离纯化采用Sephacry S‑200和DEAE‑Sepharose FF层析柱纯化，所述的核苷酸序列的5′端ATG TGT GAT CTG CCG CAA ACC CAT AGC CTG GCG以及3′端CTG CAA GAT CGTCTG CGT AAA AAA GAA TAA为经过自由能和mRNA二级结构优化的序列。