主权项 |
一种土壤微生物基因组DNA和总RNA的提取方法,包括土壤样品杂质的去除,土壤微生物细胞裂解、核酸游离及沉淀,其特征在于:所述方法具体包括以下步骤:(1)土壤样品杂质的去除:称取0.2~1.0g的新鲜作物根际土壤样品于2ml的无菌离心管中,加入40~200μl 1M pH=5.5的Tris‑HCl、V1 μl无菌双蒸水和V2 μl 0.2M Al2(SO4)3水溶液,其中V1=900μl‑V2、V2=60~300μl,涡旋震荡30s;然后加入1/3 V2体积4M NaOH溶液,以及V3体积0.1M pH=8的Tris‑HCl,其中V3=1300‑ 4/3 V2‑ V1,涡旋震荡30s,用4M NaOH溶液调节土壤溶液的pH值≥8,3500rpm离心2min,用移液枪移去上清并计算上清体积V4;(2)土壤微生物细胞裂解:在步骤(1)离心得到的沉淀中加入V5体积的0.1M pH=8的Tris‑HCl ,其中V5= V4‑650μl,再加入0.5~0.8g 0.5mm玻璃珠,0.3~0.5g 0.1mm玻璃珠和1~2个4mm玻璃珠,然后再加入325μl 10% pH=8的SDS水溶液、325μl pH=8的EB溶液,涡旋震荡30s、冰浴1min,然后再涡旋震荡1min、冰浴5min,再次涡旋震荡1min,然后4℃ 11000rpm 离心1min,取上清备用;(3)核酸游离及沉淀:取600~800μl步骤(2)得到的上清至1.5ml无菌离心管,加入与上清等体积的酚、氯仿和异戊醇混合液,其中酚:氯仿:异戊醇体积比=25:24:1,涡旋震荡,冰浴5min,期间每分钟震荡1次,最后4℃ 16000rpm离心15min;将离心后的上清转移至1.5ml离心管,加入与上清等体积的氯仿和异戊醇混合液,其中氯仿:异戊醇体积比=24:1,涡旋震荡,4℃ 16000rpm 离心15min,取上清;将上清转移至新的1.5ml离心管,加入与上清等体积的氯仿和异戊醇混合液,其中氯仿:异戊醇体积比=24:1,涡旋震荡,4℃ 16000rpm 离心15min,取上清;将上清转移至另一个1.5ml离心管,加入0.7倍上清体积的异丙醇和0.1倍上清体积3M pH=5.5的醋酸钠,4℃静置3h或‑20℃沉淀10min,然后4℃ 18000rpm 离心60min;去除上清,沉淀用5ml 75%乙醇在4℃温度下洗涤两次,然后 18000rpm 离心5min;去除上清,沉淀于无菌操作台中吹干并用30μl 0.1%DEPC水溶解,得到含有DNA和总RNA的溶液,‑80℃保存。 |