一种含有内切几丁质酶基因的重组载体

摘要

本发明涉及一种内切几丁质酶、表达该酶的基因以及含有内切几丁质酶基因的重组载体。本发明采用现代生物技术，从木霉中克隆出内切几丁质酶基因，构建了微生物表达载体，再将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中，构建高分泌型内切几丁质酶工程菌，可并利用其催化几丁质降解成几丁寡糖，实现几丁寡糖的工业化生产和产业化示范。

主权项

一种木霉内切几丁质酶cDNA的原核表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)获得木霉内切几丁质酶cDNA质粒pMD‑ECH：在液氮中将木霉菌丝体磨成粉末，用Trizol法提取总RNA，以总RNA为模板，以P1和P2为引物，P1：5′‑GACGAATTCATGTTGGGCTTCCTCGGAAAA‑3′P2：5′‑AGACTCGAGAGTTGAGACCGCTTCGGATGTT‑3′通过RT‑PCR技术扩增得到如SEQ ID NO.1所示的内切几丁质酶基因编码序列ECH，将该基因编码序列连接到pMD19‑T载体上，得质粒pMD‑ECH；(b)构建木霉内切几丁质酶cDNA的原核表达载体：用碱法提取质粒pMD‑ECH和大肠杆菌原始表达载体pET28a，以pMD‑ECH为模板，以P2和P3为引物，P2：5′‑AGACTCGAGAGTTGAGACCGCTTCGGATGTT‑3′P3：5′‑CATGAATTCGCCAGCGGATATGCAAACGCC‑3′用PCR技术扩增出无信号肽成熟的内切几丁质酶MECH片段，并用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切后插入经EcoRI和XhoI酶切的大肠杆菌表达载体pET28a的多克隆位点，得到不含信号肽的原核表达载体pET‑MECH。