一种基于位点特异性重组的基因打靶载体快速构建方法

摘要

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体为一种基于φBT1整合酶及其突变识别位点的基因打靶载体快速构建方法。本发明通过严格突变筛选和验证，提供三对突变的整合酶识别序列，突变的底物对参与反应效率与野生型相当，且在同一体系中表现为不兼容。在此基础上，构建一整套相关载体，包括一个可实现大肠杆菌-天蓝色链霉菌穿梭的骨架载体，以及三个含有突变底物对用于同源臂构建和筛选的TA克隆载体，并提供四个DNA片段体外串联重组反应的具体方法。本发明方法简单、快速并且高效，可用于链霉菌的基因打靶载体的构建；并可通过相应原件替换，广泛用于不同物种基因打靶载体的快速构建。

主权项

三对突变的φBT1整合酶识别的重组位点序列，其特征在于为attP6、attP13、attP15和attB6、xattB13、attB15位点，其序列依次如SEQ No.11、SEQ No.12、SEQ No.13以及序列SEQNo.3和SEQ No.4、SEQ No.5和SEQ No.6、SEQ No.7和SEQ No.8所示。