利用甲壳素-戊二醛交联吸附固定壳聚糖酶的方法

摘要

本发明公开了一种甲壳素-戊二醛交联吸附固定壳聚糖酶的制备方法，它包括甲壳素载体的精制、交联试剂的配制、甲壳素-戊二醛的交联、壳聚糖酶的提取及固定等步骤；即首先精制甲壳素载体，然后经戊二醛交联后，将所提取的游离壳聚糖酶进行固定。本发明克服了单独采用吸附或交联法所产生的载体吸附力弱、易解吸脱落以及酶易失活的缺点；同时与其它酶固定化方法相比较，具有半衰期长，固定化体系受外界环境影响小等特点。

主权项

一种利用甲壳素‑戊二醛交联吸附固定壳聚糖酶的方法，其特征在于它是利用甲壳素为酶固定的载体，戊二醛为交联试剂固定游离壳聚糖酶，即首先精制甲壳素载体，然后经戊二醛交联后，将所提取的游离壳聚糖酶进行固定，其具体步骤如下：a、固定化载体甲壳素的精制将分子量为2.0‑2.5×104片状的甲壳素研磨成颗粒，过20‑60目筛，室温下用蒸馏水浸泡过夜，第二天抽滤，加入3‑7mol/L HCl浸泡18‑30hr，抽滤，加入0.1‑2mol/L NaOH，煮沸1‑3hr，用蒸馏水冲洗至中性，加入0.005‑0.1mol/LNaOH溶液在30‑60℃浸泡2‑6hr，抽滤；加入0.005‑0.1mol/L醋酸溶液于30‑60℃浸泡1‑4hr，抽滤；用蒸馏水冲洗至中性，60‑90℃下干燥，得到精制的甲壳素；b、交联试剂的配制选用保存在4℃以下，生产时间为10‑30d以内的戊二醛分析纯试剂配制交联剂，使用的有效时间为2‑5个月；将浓度为2‑6％的戊二醛试剂与壳聚糖酶适宜pH值5.0‑7.0醋酸缓冲液混合，配成交联试剂；c、甲壳素的交联称取0.1‑0.5g的精制甲壳素为载体，加入上述得到的交联试剂1‑5ml，室温下浸泡并搅拌1‑5hr，静置过夜，离心去上清液；将载体用蒸馏水反复冲洗以除去残余的戊二醛，抽滤，即得交联甲壳素；交联后的载体浸泡在pH值5.0‑7.0的缓冲液中，4℃下静置，贮藏备用；d、游离壳聚糖酶的提取(1)摇瓶发酵培养产酶将培养好的假单胞菌(Pseudomonas)CUY8种子接入摇瓶发酵培养；发酵培养条件为：接种量5‑12％，葡萄糖2‑6％，壳聚糖0.5‑4％，NaCl 0.1‑2％，FeCl210‑30×10‑5g/mL，MgCl2 10‑35×10‑5g/mL，酵母膏0.1‑0.7％，(NH4)2HPO40.8％，pH值6.0‑8.0，温度30‑40℃，100‑150r/min条件下振荡培养1‑4d；(2)游离壳聚糖酶的制备经10‑50％丙酮沉淀后的壳聚糖酶通过Sephadex G‑25柱层析浓缩后，再经Sephadex G‑100柱层析进一步纯化收集壳聚糖酶蛋白，将酶蛋白溶解在1‑4ml的0.01‑0.1mol/L的乙酸缓冲液后，冰浴抽真空，浓缩真空干燥后保藏备用；e、游离壳聚糖酶的固定化将步骤(c)的交联甲壳素溶液过滤除去溶剂，取出0.1‑0.5g交联甲壳素载体，加入含有1‑10mg的游离壳聚糖酶液，于4℃下静置，期间每隔0.5‑3hr取出搅拌一次，离心取沉淀，即得固定化酶。