发明名称 |
一种抑制core1 β1-3半乳糖基转移酶的shRNA表达载体的构建方法及应用 |
摘要 |
本发明公开了一种抑制core1 β1-3半乳糖基转移酶载体的shRNA真核表达载体的构建方法及应用,其步骤是根据Genebank提供的Core1 beta1,3-galactosyltransferase的基因序列,选取一段21nt的核苷酸序列作为靶序列,设计并合成引物,通过引物退火,连接至载体psilencer1.0-U6,得到真核表达载体pu6-shRNAe,将pu6-shRNAe经肌肉注射至Balb/C小鼠,能显著降低小鼠T细胞活性,抑制小鼠免疫功能,该质粒在制备治疗或预防移植排斥反应、抑制T细胞活性的药物中应用前景广泛。 |
申请公布号 |
CN101205542B |
申请公布日期 |
2011.01.26 |
申请号 |
CN200610019901.0 |
申请日期 |
2006.08.03 |
申请人 |
武汉大学 |
发明人 |
章晓联;周霞 |
分类号 |
C12N15/79(2006.01)I;C07H21/04(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P37/00(2006.01)I |
主分类号 |
C12N15/79(2006.01)I |
代理机构 |
武汉宇晨专利事务所 42001 |
代理人 |
王敏锋 |
主权项 |
一种抑制core1 β1‑3半乳糖基转移酶的shRNA载体的构建方法,其特征是它包括下列步骤:A.靶序列的选择及引物的合成:根据GeneBank提供的Core1 beta1,3‑galactosyltransferase基因序列,选取一段21nt的核苷酸序列作为靶序列,并设计并合成引物,引物为:Oligo1.5’GCGAAGATTTAAGCCCTATGTTTCA 3’;Oligo2.5’AGCTTGAAACATAGGGCTTAAATCTTCGCGGCC 3’;Oligo3.5’AGCTTACATAGGGCTTAAATCTTCGCTTTT 3’;Oligo4.5’AATTAAAAGCGAAGATTTAAGCCCTATGTA 3’;B.pu6‑shRNAe的构建及鉴定 将Oligo1和Oligo2稀释至10pmol·ml‑1,各取2μl混合,加水稀释至20μl,95℃5min,55℃10min,然后冷却至室温,Oligo1和Oligo2退火形成双链,再与经ApaI和HindIII双酶切回收后的质粒pSilencer1.0‑U6连接,转化至感受态DH5α,挑取单个菌落,经ApaI和HindIII酶切鉴定,克隆标记为pU6‑galt12;pU6‑galt12经Apa I和HindIII双酶切,回收后与Oligo3和Oligo4的退火产物连接,转化至感受态DH5α,挑取单个菌落,经EcoR I和HindIII酶切鉴定,克隆经测序鉴定,得到重组质粒pu6‑shRNAe;C.特异性pu6‑shRNAe转染CT‑26细胞提取pu6‑shRNAe质粒,测定DNA浓度,将4μg DNA加入250μl无血清RPMI 1640培养基中,另取240μl无血清RPMI 1640培养基,其中加入10μl Lipofectamine 2000脂质体,5分钟内混合含DNA和脂质体的上述培养基,30分钟后将上述混合物加入CT‑26细胞中;D.RT‑PCR检测目的基因的表达:转染48h后收获上述转染的细胞,提取细胞的总RNA,进行RT‑PCR,内参G3DPH上游引物为:5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′,下游引物为:5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′,core1 β1‑3半乳糖基转移酶基因上游引物:5′CAGTCACCTCAAAGGACAGA 3′,下游引物:5′GGAATCTCCAGC‑TTCTACAT 3′,PCR反应体系为:10×Taq DNA聚合酶缓冲液 5μl25mM MgSO4 3μl10mM dNTP 1μl上游引物20μM 1μl下游引物20μM 1μl模板 1μlTaq DNA聚合酶 1μl灭菌双蒸水 37μl总体积 50μl反应条件:95℃,5min;95℃,36sec;60℃,36sec;72℃,84sec;共28个循环;72℃,5min,将PCR产物进行凝胶电泳并测定灰度,将目的基因与内参G3PDH的比值进行比较判断目的基因表达。 |
地址 |
430072 湖北省武汉市武昌珞珈山 |