红曲米固态发酵生产凝乳酶的方法

摘要

本发明涉及一种红曲米固态发酵生产凝乳酶的方法。将红曲米粉接种到固态发酵培养基上，28-30℃恒温培养90-96h；培养水提、浓缩得凝乳酶溶液；加入乙醇进行醇沉两次，冷冻升华干燥得凝乳酶粗酶，然后纯化得凝乳酶。本发明利用传统发酵工艺与现代生物制剂技术相结合生产凝乳酶，本发明原料来源广泛、价格低廉、产率高，所产凝乳酶活力高。

主权项

一种红曲米固态发酵制备凝乳酶的方法，步骤如下：1)红曲米粉碎成粉状，细度200‑400目，将红曲米粉接种到固态发酵培养基上，28‑30℃恒温培养90‑96h；所述的固态发酵培养基是：按干物质的质量百分比麸皮40％‑50％和豆粕50％‑60％，加入麸皮与豆粕总质量0.5％‑1％的葡萄糖，加水使固液比1∶1.5‑1∶2质量比；2)向上述步骤1)得到的培养物中加入蒸馏水，蒸馏水体积是培养物体积的2‑2.5倍，抽滤，取滤液，旋转蒸发仪浓缩至原体积1/3‑1/4，得凝乳酶溶液；3)向上述步骤2)得到的凝乳酶溶液加入乙醇进行醇沉两次，两次醇沉中使用的乙醇体积均是凝乳酶溶液体积的2‑3倍，4‑6℃低温离心，冷冻升华干燥，即为凝乳酶粗酶；第一次醇沉中使用的乙醇浓度为72％wt，第二次醇沉中使用的乙醇浓度为95％wt；4)将上述步骤3)得到的凝乳酶粗酶溶于pH为6.2的磷酸缓冲液中，即为凝乳酶粗液；5)使用Sephadex G‑75凝胶柱层析纯化步骤4)得到的凝乳酶粗液，以pH6.2的磷酸缓冲液作为洗脱液，分步收集，检验收集液的活性，合并有活性的洗脱液；6)利用DEAE‑纤维素52对上述步骤5)得到的洗脱液进一步纯化，以pH7.2的磷酸盐缓冲液为起始缓冲液，采用NaCl梯度洗脱，分步收集，检测活性，合并有活性洗脱液，浓缩冻干得凝乳酶；所述采用NaCl梯度洗脱是用0.15mol/L、0.25mol/L、0.35mol/L、0.45mol/L和0.55mol/LNaCl浓度的缓冲液进行梯度洗脱。