木聚糖酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法

摘要

本发明涉及具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的酶，其例如催化内部β-1，4-木糖苷键或内β-1，4-葡聚糖键的水解；和/或将线性多糖β-1，4-木聚糖降解成木糖。因此，本发明提供分解作为植物细胞壁主要成分的半纤维素的方法和过程，包括水解任何植物或木材或木制品、废木料、纸浆、纸制品或废纸或纸副产品中的半纤维素的方法和过程。另外，还提供设计新木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶的方法和其应用方法。所述木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶在增加的pH和温度下具有增加的活性和稳定性。

主权项

分离的、合成的或重组的核酸(多核苷酸)，其包含(a)编码至少一种多肽的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸包含与下列核酸序列具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或完全(100％)序列同一性的序列：(i)SEQ ID NO：1的核酸(多核苷酸)序列，其具有表1中所述的一个或更多个核苷酸残基改变(或其等价物)，或具有下列核苷酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部：编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为AAC；编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CGC；编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CAC；编码氨基酸残基9的密码子由CCC变为GAC；编码氨基酸残基17的密码子由TTC变为GTC；编码氨基酸残基21的密码子由TTC变为TAC；编码氨基酸残基33的密码子由CTG变为GCG；编码氨基酸残基38的密码子由CGT变为CAC；编码氨基酸残基44的密码子由AGC变为ACG；编码氨基酸残基63的密码子由ATC变为GTC；编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为TAC；编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GAG；编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GTC；编码氨基酸残基108的密码子由TTC变为AAG；编码氨基酸残基125的密码子由CAG变为TAC；编码氨基酸残基1 50的密码子由GTA变为GCC；编码氨基酸残基188的密码子由AGC变为GAG和/或编码氨基酸残基189的密码子由TCC变为CAG；或(ii)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23的核酸(多核苷酸)序列；其中(i)或(ii)的所述核酸编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽，或编码能够产生木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特异性抗体(起表位或免疫原作用的多肽或肽)的多肽或肽，(b)(a)的核酸(多核苷酸)，其中所述序列同一性如下测定：(A)通过用序列比对算法分析或通过视觉观察，或(B)在至少约20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或更多个残基的区域上，或在cDNA、转录物(mRNA)或基因的全长上；(c)(a)或(b)的核酸(多核苷酸)，其中所述序列比对算法是2.2.2版BLAST算法，其中过滤设置被设置为blastall‑p blastp‑d″nr pataa″‑F F并且所有其它选项被设置为默认值；(d)编码至少一种多肽或肽的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸包含在严格条件下与这样的核酸杂交的序列：所述核酸包含SEQ ID NO：1的核酸(多核苷酸)序列以及具有表1中所述的一个或更多个核苷酸残基改变(或其等价物)，或具有下列核苷酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部改变：编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为AAC；编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CGC；编码氨基酸残基4的密码子由ACC变为CAC；编码氨基酸残基9的密码子由CCC变为GAC；编码氨基酸残基17的密码子由TTC变为GTC；编码氨基酸残基21的密码子由TTC变为TAC；编码氨基酸残基33的密码子由CTG变为GCG；编码氨基酸残基38的密码子由CGT变为CAC；编码氨基酸残基44的密码子由AGC变为ACG；编码氨基酸残基63的密码子由ATC变为GTC；编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为TAC；编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GAG；编码氨基酸残基73的密码子由GGC变为GTC；编码氨基酸残基108的密码子由TTC变为AAG；编码氨基酸残基125的密码子由CAG变为TAC；编码氨基酸残基150的密码子由GTA变为GCC；编码氨基酸残基188的密码子由AGC变为GAG；和/或编码氨基酸残基189的密码子由TCC变为CAG，其中所述多肽或肽具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性或能够产生木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶特异性抗体(起表位或免疫原作用的多肽或肽)，以及所述严格条件包括这样的洗涤步骤，其包含在约65℃温度下于0.2×SSC中洗涤约15分钟；(e)编码至少一种多肽或肽的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸包含在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23序列的核酸杂交的序列，以及所述严格条件包括这样的洗涤步骤，其包含在约65℃温度下于0.2×SSC中洗涤约15分钟；(f)(a)至(d)中任意的核酸(多核苷酸)，其长度为至少约20、25、30、50、75、100、125、150、175、200、225、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或更多个核苷酸残基，或基因或转录物的全长；(g)编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽的核酸(多核苷酸)，其中所述多肽包含SEQ ID NO：2的序列或其酶促活性片段，以及具有表1中所述的至少一个氨基酸残基改变(或其等价物)，或具有下列氨基酸残基改变中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个或一些或全部改变：氨基酸残基4从T(或thr或苏氨酸)变为N(或asn或天冬酰胺)；氨基酸残基4从T(或thr或苏氨酸)变为R(或arg或精氨酸)；氨基酸残基4从T(或thr或苏氨酸)变为H(或his或组氨酸)；氨基酸残基9从P(或pro或脯氨酸)变为D(或asp或天冬氨酸))；氨基酸残基17从F(或phe或苯丙氨酸))变为V(或val或缬氨酸)；氨基酸残基21从F(或phe或苯丙氨酸))变为Y(或tyr或酪氨酸)；氨基酸残基33从L(或leu或亮氨酸)变为A(或ala或丙氨酸))；氨基酸残基38从R(或arg或精氨酸)变为H(或his或组氨酸)；氨基酸残基44从S(或ser或丝氨酸)变为T(或thr或苏氨酸)；氨基酸残基63从I(或ile或异亮氨酸))变为V(或val或缬氨酸)；氨基酸残基73从G(或gly或甘氨酸)变为Y(或tyr或酪氨酸)；氨基酸残基73从G(或gly或甘氨酸)变为V(或val或缬氨酸)；氨基酸残基73从G(或gly或甘氨酸)变为E(或glu或谷氨酸)；氨基酸残基108从F(或phe或苯丙氨酸)变为K(或lys或赖氨酸)；氨基酸残基125从Q(或gln或谷氨酰胺)变为Y(或tyr或酪氨酸)；氨基酸残基150从V(或val或缬氨酸)变为A(或ala或丙氨酸))；氨基酸残基188从S(或ser或丝氨酸)变为E(或glu或谷氨酸)；和/或氨基酸残基189从S(或ser或丝氨酸)变为Q(或gln或谷氨酰胺)；(h)编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的至少一种多肽的核酸(多核苷酸)，其中所述多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24的序列或其酶促活性片段；(i)(A)(a)至(h)中任意的核酸(多核苷酸)并且编码这样的多肽，所述多肽具有至少一个保守氨基酸替代并且保持其木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性；或(B)(i)(A)的核酸，其中至少一个保守氨基酸替代包括用相似特性的另一种氨基酸替代氨基酸；或保守替代包括：用另一种脂肪族氨基酸置换脂肪族氨基酸；用苏氨酸置换丝氨酸或反之亦然；用另一种酸性残基置换酸性残基；用带有酰胺基团的另一种残基置换带有酰胺基团的残基；用另一种碱性残基交换碱性残基；或用另一种芳香族残基置换芳香族残基；(j)(a)至(i)的任意核酸(多核苷酸)，其编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽，但缺少信号序列、前原结构域、锚定结构域和/或糖结合模块(CBM)；(k)(j)的核酸(多核苷酸)，其中所述糖结合模块(CBM)包含木聚糖结合模块、纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块或由其组成；(l)(a)至(k)的任意核酸(多核苷酸)，其编码具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性的多肽，进一步包含异源序列；(m)(l)的核酸(多核苷酸)，其中所述异源序列包含编码下列的序列或由其组成：(A)异源信号序列、异源糖结合模块、异源锚定结构域、异源催化结构域(CD)或其组合；(B)(l)的序列，其中所述异源信号序列、糖结合模块或催化结构域(CD)源自异源酶；或(C)标记、表位、靶向肽、可切割序列、可检测部分或酶；(n)(l)的核酸(多核苷酸)，其中所述异源糖结合模块(CBM)包含木聚糖结合模块、纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木糖葡聚糖特异性模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块或由其组成；(o)(l)的核酸(多核苷酸)，其中所述异源信号序列将编码的蛋白靶向液泡、内质网、叶绿体或淀粉颗粒；或(p)与(a)至(o)的任意序列充分(完全)互补的核酸序列(多核苷酸)。