纳米脂质体抗蛇毒活性酶A2和肠道病原体特异性复合IgY及其应用

摘要

本发明公开了一种纳米脂质体化抗蛇毒活性酶A2(含脂蛋白磷脂酶A2、磷脂酶A2)和肠道病原体特异性复合IgY以及抗蛇毒活性酶A2(含脂蛋白磷脂酶A2、磷脂酶A2)特异性IgY的制备方法，包括以下步骤：(1)采用基因工程技术重组脂蛋白磷脂酶A2和磷脂酶A2表达蛋白，(2)制备畜禽水生动物肠道主要病原体复合抗原，(3)制备抗蛇毒活性酶A2和肠道病原体特异性复合IgY以及抗蛇毒活性酶A2特异性IgY，(4)制备抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生物肠道病原体特异性复合IgY粗品；(5)抗蛇毒活性酶A2和肠道病原体特异性复合IgY以及抗蛇毒活性酶A2特异性IgY纳米化和脂质体化。以这种特异性复合IgY或IgY制成的畜禽水生动物用饲料或饲料添加剂，可增强动物肠道健康，抑制会影响营养吸收的特殊磷脂酶，改善饲料转化效率。

主权项

一种纳米脂质体化的抗蛇毒活性酶A2和肠道病原体特异性复合IgY的制备方法，它可以是抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY，其特征在于包括以下步骤：(1)采用基因工程技术重组脂蛋白磷脂酶A2表达蛋白，首先用RT‑PCR方法克隆脂蛋白磷脂酶A2的成熟肽编码区基因；然后将脂蛋白磷脂酶A2基因从真核表达载体pCGN‑PLD1亚克隆至带有绿色荧光标记蛋白的穿梭质粒pAdTrack‑CMV中；再与腺病毒骨架载体一起在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，阳性重组子经Pac I线性化后，转染入病毒组装细胞系293细胞，构建专一性的脂蛋白磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白，并用该病毒颗粒感染嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞，高效表达脂蛋白磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白；把已被鉴定的脂蛋白磷脂酶A2重组腺病毒表达蛋白用氯化铯梯度离心纯化，再在QBI‑293A细胞中进行大量扩增；(2)制备畜禽和水生动物肠道主要病原体复合抗原：首先筛选引致畜禽和水生动物肠道感染性疾病的主要病原体，并进行分类组合；再分别制备相应的各种复合抗原；(3)制备含抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY的免疫蛋：选择具有高免疫应答能力的正在产蛋的无特定病原体携带的健康产蛋禽，分别采用制备的各种复合抗原在皮下注射，在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次，第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第3次，第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋，并对应不同的抗原，对所检取的免疫蛋进行编码标记；(4)制备抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY粗品，首先将不同抗原分别免疫的禽所产高免疫蛋用0.5％新洁而灭溶液或0.1％KMnO4溶液或其它同类消毒液将免疫蛋浸泡15‑30分钟消毒，无菌蒸馏水冲洗、晾干，置于打蛋机中将蛋壳打碎，用蛋黄筛滤除蛋清留下蛋黄加入4‑8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/L的NaOH溶液或者1mol/L的HCL溶液调节PH至5.5～6.0，4～6℃下静置8小时左右，稀释液通过8000‑12000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩；然后，采用除病毒过滤系统的细菌病毒滤除装置，彻底滤除各种细菌病毒，以确保所制备的IgY绝不含任何病毒和细菌；将制得的不同的抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY，进一步组合成更多种不同的抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY；(5)抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY纯品制备，将所制得的各种抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY粗品分别过离子交换柱和凝胶交换柱进行纯化，即得相应的复合纯IgY；(6)抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY纳米化，首先取所制成的各种抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY浓缩液用冷冻干燥机干燥，即制得各种抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY干粉；再将所得干粉加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1‑100nm之间、粒度≥15000目的超微粒子，制得相应的纳米化抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY或IgY干粉；(7)把纳米化抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY制成脂质体液晶微囊，把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将任意一种纳米化抗脂蛋白磷脂酶A2和畜禽水生动物肠道病原体特异性复合IgY加入4mmol/L磷酸盐缓冲液配成IgY溶液，以每处理0.5min间歇0.5min的方式超声处理2min，立即在水浴中减压旋转蒸发至凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而35000r/min超速离心30min以分离除去未包入的IgY，沉淀后用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/L的磷酸盐缓冲液稀释，即制得纳米脂质体化的抗脂蛋白磷脂酶A2和肠道病原体特异性复合IgY。