固相多肽合成鲑鱼降钙素的制备方法

摘要

本发明公开了一种固相多肽合成鲑鱼降钙素的制备方法。本发明利用Fmoc-策略固相法制备鲑鱼降钙素的新工艺。包括以下步骤：a.Fmoc-Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂脱Fmoc-保护后按照固相合成的方法依次连接各种保护氨基酸得到保护三十二肽树脂；b.其间依次脱去Fmoc-保护基团；c.脱侧链保护基团及切肽同步进行，得还原型粗品；d.粗品经弱碱(pH7.5-10.0)空气氧化反应，并经反相HPLC分离纯化，制得鲑鱼降钙素精品。本发明具备规模生产能力，工艺简单，成本低，三废少，质量上乘(纯度≥98％)。接肽收率高(每步接肽收率为≥99％)。总收率约为：17.2％，便于工业化实施，具有较大的产业化前景。

主权项

一种固相多肽合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步：(1)将Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，氮气吹干，加入六氢吡啶的DMF溶液，反应10～50分钟，氮气吹滤去除六氢吡啶，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(A)；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为10～30％，Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(2)在步骤(1)的(A)中加入Fmoc‑Pro‑OH，TBTU或HBTU，HOBT，NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，15～35℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(B)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(A)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Pro‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(A)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(3)在步骤(2)的(B)中加Fmoc‑Thr(tBu)‑OH，TBTU或HBTU，HOB T，NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，15～35℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(C)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(B)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Thr(tBu)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(B)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(4)在步骤(3)的(C)中加入Fmoc‑Gly‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干； 加入六氢吡啶的DMF溶液，15～35℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(D)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(C)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Gly‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(C)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(5)在步骤(4)的(D)中加入Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，15～35℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(E)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(D)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Ser(tBu)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(D)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(6)在步骤(5)的(E)中加Fmoc‑Gly‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(F)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(E)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Gly‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(E)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(7)在步骤(6)的(F)中加Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干； 加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(G)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(F)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Thr(tBu)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(F)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(8)在步骤(7)的(G)中加Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(H)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(G)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Asn(Trt)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(G)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(9)在步骤(8)的(H)中加Fmoc‑Thr(tBu)‑OH，TBTU或HBTU、HOBT、NMM 16.5ml和250mlDMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(I)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(H)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Thr(tBu)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(H)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(10)在步骤(9)的(I)中加Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干； 加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(J)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(I)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Arg(Pbf)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(I)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(11)在步骤(10)的(J)中加Fmoc‑Pro‑OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(K)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(J)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Pro‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(J)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(12)在步骤(11)的(K)中加Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH、TBTU、HOBT、MM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(L)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(K)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(K)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(13)在步骤(12)的(L)中加Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干； 加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(M)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(L)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Thr(tBu)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(L)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(14)在步骤(13)的(M)中加Fmoc‑Gln(Trt)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(N)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(M)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Gln(Trt)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(M)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(15)在步骤(14)的(N)中加Fmoc‑Leu‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(O)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(N)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Leu‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(N)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(16)在步骤(15)的(O)中加Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干； 加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(P)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(O)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Lys(Boc)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(O)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(17)在步骤(16)的(P)中加Fmoc‑His(Trt)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(Q)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(P)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑His(Trt)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(P)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(18)在步骤(17)的(Q)中加Fmoc‑Leu‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(R)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(Q)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Leu‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(Q)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(19)在步骤(18)的(R)中加Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干； 加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(S)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(R)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(R)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(20)在步骤(19)的(S)中加Fmoc‑Gln(Trt)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(T)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(S)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Gln(Trt)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(S)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(21)在步骤(20)的(T)中加Fmoc‑Ser(tBu)‑OH 28.5g，TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(U)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(T)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Ser(tBu)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(T)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(22)在步骤(21)的(U)中加Fmoc‑Leu‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干； 加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(V)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(U)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Leu‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(U)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(23)在步骤(22)的(V)中加Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(X)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(V)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Lys(Boc)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(V)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～205毫升/克；(24)在步骤(23)的(X)中加Fmoc‑Gly‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(Y)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(X)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Gly‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(X)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(25)在步骤(24)的(Y)中加Fmoc‑Leu‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干； 加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(Z)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(Y)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Leu‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(Y)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(26)在步骤(25)的(Z)中加Fmoc‑Val‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(Z1)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(Z)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Val‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(Z)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(27)在步骤(26)的(Z1)中加Fmoc‑Cys(Trt)‑OH 43.6g，TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(Z2)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(Z1)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Cys(Trt)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(Z1)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(28)在步骤(27)的(Z2)中加Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干； 加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(Z3)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(Z2)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Thr(tBu)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(Z2)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(29)在步骤(28)的(Z3)中加Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(Z4)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(Z3)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Ser(tBu)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(Z3)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(30)在步骤(29)的(Z4)中加Fmoc‑Leu‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(Z5)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(Z4)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Leu‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(Z4)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(31)在步骤(30)的(Z5)中加Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干； 加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(Z6)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(Z5)的重量浓度为5～20％；Fmoc‑Asn(Trt)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(Z5)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(32)在步骤(31)的(Z6)中加Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；加入六氢吡啶的DMF溶液，20～30℃反应10～50分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得(Z7)；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(Z6)的重量浓度为5～20％Fmoc‑Ser(tBu)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的重量浓度为15～35％，(Z6)与六氢吡啶的DMF溶液的重量体积浓度为5～20毫升/克；(33)在步骤(32)的(Z7)中加Fmoc‑Cys(Trt)‑OH、TBTU或HBTU、HOBT、NMM和DMF，反应，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；甲醇洗涤，抽干，干燥，获得保护的32肽树脂；NMM和DMF的体积比为：NMM∶DMF＝1∶5～15；含有NMM与DMF的混合溶液中：(Z7)的重量浓度为5～20％，Fmoc‑Cys(Trt)‑OH与树脂的摩尔比为2～5∶1；TBTU或HBTU与树脂的摩尔比为2～5∶1；HOBT与树脂的摩尔比为2～5∶1；第2步：加入切肽试剂TFA/EDT/H2O/TIS进行切肽，并脱侧链保护基团，然后加入乙醚沉淀粗品，获得还原型鲑鱼降钙素粗品；第3步：通空气氧化，过滤，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品； 第4步：在C18或C8柱中进行分离纯化，获得目标产物。