高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法

摘要

本发明公开一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法，是利用分子克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组中克隆了全长glmU基因，并对全glmU基因进行改造，只保留编码葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的基因片段，同时建立了高表达葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的大肠杆菌工程菌株。利用亲和层析技术从工程菌株中纯化得到葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶，建立了快速、准确测定葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性的方法，该酶活性测定方法是筛选葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂的分子模型，用于高通量筛选组合化合物库、中药及天然产物的结核分枝杆菌葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶抑制剂。

主权项

一种高通量筛选结核分枝杆菌葡糖胺‑1‑磷酸乙酰基转移酶抑制剂的方法，其特征在于依次按如下步骤进行：a.用分子克隆技术从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组中克隆glmU基因，从glmU基因的5’端进行DNA序列删除，获得保留3’端的glmU基因片段glmU‑C；b.将基因片段glmU‑C克隆到pET载体，构建出pET‑glmU‑C表达载体；c.将pET‑glmU‑C表达载体转化到大肠杆菌中，构建出表达葡糖胺‑1‑磷酸乙酰转移酶的工程菌株MTGC08(Escherichia coli MTGC08)，保藏编号CGMCC3419；d.将工程菌株MTGC08接种到卡那霉素的LB培养基中，在37℃培养4小时，用浓度为0.2mM的IPTG进行诱导；e.收获细菌，破碎细胞，离心后取上清，采用组氨酸‑Ni2+亲和层析技术纯化得到GlmU‑C蛋白；f.将2ug GlmU‑C蛋白与pH 7.5的50mM Tris‑HCl、0.4mM乙酰CoA及0.4mM葡糖胺‑1‑磷酸构成50μl的酶促反应体系，将被筛选物按0.1～5ug/ml浓度加入酶促反应体系中，在30℃孵育5分钟，加入50μl 6M盐酸胍终止反应，再加入50μl DTNB显色剂显色10分钟，用酶标仪检测405nm处的吸光度值；g.将所测吸光度值与反应条件同f步骤、酶促反应体系中无被筛选物时测得的GlmU‑C蛋白在405nm处的标准吸光度值进行对比，筛选结核分枝杆菌葡糖胺‑1‑磷酸乙酰基转移酶抑制剂。