一种基于功能基因多态性的分子标记方法

摘要

本发明公开了一种基于功能基因多态性的分子标记方法。其中包括利用已知物种的公用数据库中的gDNA、cDNA或EST序列信息，设计不同基因的特异引物和高频序列引物并配合其相应的退火温度进行PCR扩增，可实现gDNA单基因多态性、同源性基因家族多态性和mRNA反转录后的cDNA多态性分析，易于与生物形态性状、生理生化特征或某个特定的环境适应型相联系。

主权项

一种基于功能基因多态性的分子标记方法，利用已知物种的公用数据库中的gDNA、cDNA或EST序列信息，设计不同基因的特异引物和高频序列引物并配合其相应的退火温度，作为基于PCR的功能基因扩增多态性标记方法，其特征是通过下述步骤进行：(1)根据公用数据库目的基因的cDNA或EST序列设计多对候选特异引物，经电子PCR后，选择只有一个PCR产物、扩增片段位于基因易变的中心区域及引物长度最短的一对特异引物，进一步实际PCR验证其特异性并确定所需退火温度；(2)根据公用数据库目的基因的gDNA序列，分别按2个、3个和4个不同碱基可能的排列组合，查找在目的基因gDNA序列中出现频率高的序列为高频序列引物的3`端选择性碱基，然后在5`端填充不同碱基以合符一般引物设计要求；(3)根据目的基因序列同源性分析，在公用数据库已知的同源性基因家族各序列中，分别按2个、3个和4个不同碱基可能的排列组合，查找共同出现频率高的序列为高频序列引物的3`端选择性碱基，然后在5`端填充不同碱基以合符一般引物设计要求；(4)以上游特异引物与不同的下游高频序列引物组合、下游特异引物与不同的上游高频序列引物组合；以前4‑8个循环采用低退火温度，循环次数在第4‑8到第34‑42次采用特异性扩增所需的高退火温度，进行PCR、凝胶电泳后筛选基因多态性引物组合；(5)进一步地，从生物体提取RNA后，经反转录酶将RNA反转录为cDNA，以目的基因下游特异引物与上游高频序列引物组合；以前4‑8个循环采用低退火温度，循环次数在第4‑8到第34‑42次采用高退火温度，进行PCR、凝胶电泳后检测基因表达多态性。