一种重组质粒、构建方法和用于红霉素产生菌的遗传改造

摘要

本发明公开了一种基因工程构建的重组质粒，以及该重组质粒的构建方法和该质粒在红霉素产生菌遗传改造上的应用。重组质粒由载体和在多克隆位点加入一个含有红霉素启动子，大环骨架上碳12位羟基化酶，碳霉糖甲基化酶组合的片段组成，其中载体为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒，可以为pKC1139、pOJ260、pWHM3或pSET152等类似的载体；所述的组合，主要特征是含有红霉素启动子(ErmE*)为m个，羟基化酶(EryK)为n个，甲基化酶(EryG)为k个，其中，m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4，它们可以任意搭配组合。使用这样的重组质粒对红霉素产生菌进行遗传改造，可以明显改善组分，甚至获得只产生有效单一组分的生产菌种。

主权项

一种基因工程构建的重组质粒，由载体和在多克隆位点加入一个红霉素启动子ErmE*为m个，大环骨架上碳12位羟基化酶EryK为n个，碳霉糖甲基化酶EryG为k个组合的片段组成，其中载体为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒，其特征在于，所述的红霉素启动子，羟基化酶和甲基化酶之间按所述数目任意搭配组合，为如下所示的结构：(X)m (Y)n (Z)k I其中，X为红霉素启动子ErmE*，所述的红霉素启动子为如下的核苷酸序列：TTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAACTCCTTTAGTTGTTCCTTTCTATTCTCACTCCGCTGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGAACTAGAAGCCCGACCCGAGCACGCGCCGGCACGCCTGGTCGATGTCGGACCGGAGTTCGAGGTACGCGGCTTGCAGGTCCAGGAAGGGGACGTCCATGCGAGTGTCCGTTCGAGTGGCGGCTTGCGCCCGATGCTAGTCGCGGTTGATCGGCGATCGCAGGTGCACGCGGTCGATCTTGACGGCTGGCGAGAGGTGCGGGGAGGATCTGACCGACGCGGTCCACACGTGGCACCGCGATGCTGTTGTGGGCACAATCGTGCCGGTTGGTA；Y为红霉素生物合成过程中大环骨架上碳12位羟基化酶EryK，为如下的核苷酸序列：CACCGCGGAAGTCTCGACACCCCGTCCGGCGCGCGACTAAGCTCAAGATCGCGACGCGTGTTCGCCGACGTGGAAACGACCTGCTGCGCGAGGAGAACGTTGACCACCATCGACGAAGTTCCCGGCATGGCCGACGAAACCGCACTCCTCGACTGGCTGGGCACGATGCGCGAGAAGCAGCCGGTGTGGCAGGACCGGTACGGCGTGTGGCACGTCTTCCGCCACGCCGACGTCCAGACGGTGTTGCGCGACACCGCCACGTTCTCCTCCGACCCGACCCGCGTCATCGAGGGCGCGAGCCCGACGCCGGGCATGATCCACGAGATCGACCCGCCGGAGCACCGCGCCCTGCGCAAGGTCGTCAGCAGCGCCTTCACCCCGCGCACCATCTCCGACCTCGAACCCCGCATCCGCGACGTCACCCGCTCGCTGCTGGCCGATGCCGGCGAGAGCTTCGACCTCGTCGACGTGCTCGCGTTCCCGCTGCCGGTCACGATCGTCGCGGAGCTGCTGGGCCTGCCGCCGATGGACCACGAGCAGTTCGGCGACTGGTCGGGTGCCCTGGTCGACATCCAGATGGACGACCCGACCGACCCGGCGCTGGCCGAACGGATCGCGGATGTGCTCAACCCGCTCACCGCGTACCTGAAGGCCCGCTGCGCCGAGCGCCGCGCCGATCCCGGCGACGACCTGATCTCCCGCCTTGTCCTGGCCGAGGTCGACGGGCGCGCGCTCGACGACGAGGAGGCGGCCAACTTCTCCACCGCGCTGCTGCTGGCCGGCCACATCACCACGACCGTCCTGCTCGGCAACATCGTGCGCACCCTCGACGAGCACCCGGCCCACTGGGACGCCGCCGCCGAGGACCCCGGCCGGATCCCGGCGATCGTCGAGGAGGTCCTGCGCTACCGGCCGCCGTTCCCGCAGATGCAGCGCACGACGACCAAGGCCACCGAGGTCGCGGGCGTGCCCATCCCGGCCGACGTCATGGTCAACACCTGGGTGCTCTCGGCCAACCGCGACTCCGACGCCCACGACGACCCCGACCGGTTCGACCCGTCGCGCAAGTCCGGCGGCGCCGCGCAGCTCTCCTTCGGCCACGGCGTGCACTTCTGCCTCGGCGCGCCCCTGGCCCGGCTGGAGAACCGCGTGGCGCTGGAGGAGATCATCGCCCGGTTCGGGCGGCTCACCGTCGACCGCGACGACGAGCGCCTGCGCCACTTCGAACAGATCGTGCTCGGGACCCGTCACCTGCCGGTGCTGGCGGGCTCCTCGCCGAGGCAGTCGGCGTAGTCGGGCAGCATCCCTCGCCGCCTGGCGGTCTCCAGGTCCACGGCCACCGTGTCGCGGTCGGAGAGCACGACCTCCAGGTCCGCGGGCCACGGCAGACCCAGCGCGGGGTCGAACGGGTCGATCGCCTGCTCGTACTCGGCCACGTACGGCGTGCTGACCAGGTACGACATCAGGGTGTCGTCCTCAAGCGCGAGGAAGGCGTGCGCGGTGCCCCTGGGGAAGTAGACCGCCCGGAAGTGCTCGGTGTCCATCTCCACCGCGTCCCACTTCCCGAACGTCGGCGAGCCGACCCGGATGTCGACGATGACGTCGAGCGCCCGGCCGCGCGCGCAGTAGACGTACTTGCACTGCCCCGGCG；Z为红霉素碳霉糖甲基化酶EryG，为如下的核苷酸序列：GGTGCTGTTGCCGTCCCTGCGCCCGGCGATCGAGGCCTACGAGAAGTTCTGCCGCAACCTCGGCGAAGACCCGGCCGAGGTGGGGCTCGCATGGGTGCTGTCCCGGCCCGGCATCGCCGGCGCCGTCATCGGCCCGCGAACCCCCGAGCAGCTCGACTCCGCGCTGAAGGCGTCCGCGATGACCCTGGACGAGCAGGCGCTGTCCGAACTGGACGAGATCTTCCCCGCGGTGGCCTCCGGCGGCGCGGCGCCGGAAGCCTGGTTGCAGTGAGCACAAGAGGAACCGAGAAAGGATACGGCTGGTGAGCGTGAAGCAGAAGTCAGCGTTGCAGGACCTGGTCGACTTCGCCAAGTGGCACGTGTGGACCAGGGTGCGGCCGTCCAGCCGTGCGCGCCTGGCCTACGAGCTGTTCGCCGACGACCACGAGGCCACGACCGAGGGCGCCTACATCAACCTCGGCTACTGGAAGCCCGGGTGCGCCGGCCTGGAGGAGGCCAACCAGGAGCTGGCGAACCAGCTCGCCGAGGCCGCGGGGATCAGCGAGGGCGACGAGGTGCTCGACGTCGGGTTCGGGCTCGGCGCGCAGGACTTCTTCTGGCTCGAGACGCGCAAGCCGGCCAGGATCGTCGGCGTCGACCTGACCCCGAGCCACGTCCGCATCGCCTCCGAGCGCGCGGAGCGCGAGAACGTGCAGGACCGCCTGCAGTTCAAGGAGGGCTCGGCGACCGACCTGCCCTTCGGCGCGGAGACCTTCGACCGCGTCACCTCCCTGGAGTCGGCCCTGCACTACGAGCCGCGGACCGACTTCTTCAAGGGCGCGTTCGAGGTGCTCAAGCCCGGAGGCGTGCTGGCCATCGGCGACATCATCCCGCTCGACCTGCGCGAGCCCGGTTCCGACGGACCGCCGAAGCTGGCGCCGCAGCGGTCGGGATCGCTGTCCGGCGGCATCCCGGTGGAGAACTGGGTGCCCCGCGAGACCTACGCCAAGCAGCTCCGCGAAGCGGGCTTCGTCGACGTCGAGGTGAAGTCGGTCCGCGACAACGTGATGGAGCCCTGGCTGGACTACTGGCTGCGCAAGCTGCAGGACGAGTCGTTCAAGAAGAGCGTGAGCAGGCTCTTCTACAGCCAGGTCAAGCGGTCGCTGACCAGCGACTCGGGCATGAAGGGCGAGCTGCCCGCGCTCGACTTCGTGATCGCCTCAGCCCGCAAGCCCGGCGCGTAGCAGGTCCCGGCGCACGGCACCGGCCACCTCGGTGACCTGTTCACCCAGGTAGAAGTGCCCGCCGGGGAAGGTCCTGGTCCGGCCGGGGATGACCGAGTGCTGCAACCAGCGCTCGGCGTCCCCGGTCGCGGTCAGCGGGTCGGCGTCGCCGCACAGCGCGGTGATGCCGGCCCGCAGCGGTGGTCCGTCCGCCCAGGCGTAGGAGCGCAGCACGCGGTAG；其中m＝1～3，n＝1～5，k＝0～4。