唐古特大黄药材DNA提取方法

摘要

本发明提供一种从唐古特大黄药材提取DNA的方法，该方法是将唐古特大黄干药材用蒸馏水浸泡24h后，切成小碎块，晾干，研磨至粉末；再将药材粉末用提取介质I和β-巯基乙醇进行提取，然后再用提取介质II和β-巯基乙醇进行提取，产物由氯仿/异戊醇抽提后，水相加入NaAc(pH5.2)和冰冷的异丙醇使DNA沉淀，弃去液相，沉淀用75％乙醇洗涤2～3次，去乙醇自然风干；用灭菌ddH 2O溶解DNA，4℃保存或-20℃下放置长期保存。经电泳检测，提取的大黄药材DNA是完整的基因组DNA，纯度较高(A 260/A 280＝1.8-2.0之间)。所得基因组DNA作模板，分别用UBC888和UBC891引物对药材基因组DNA进行扩增，能得到条带清晰的图谱。

主权项

一种唐古特大黄药材DNA提取方法，包括以下工艺步骤：(1)药材的预处理：将唐古特大黄干药材用0～4℃的蒸馏水浸泡20～48h，然后切成小碎块，凉干备用；(2)将经处理的大黄药材置于研钵中研磨至粉末状；研磨的同时加入大黄药材体积2～3％的PVP干粉；(3)将研磨好的干粉转入离心管中，加入药材粉末体积5～10倍提取介质I和药材粉末体积0.5～1％的β 巯基乙醇，于 1～10℃提取10～15min；所述提取介质I由pH8.0的200mmol/L Tris HCl，pH8.0的50mmol/L EDTA，0.25mol/LNaCl组成；(4)于0～4℃，2000r/min下离心8～10min，收集沉淀；(5)在离心分离的沉淀中加入沉淀体积4～5倍的提取介质II和沉淀体积0.5～1％的β 巯基乙醇，在60～65℃下水浴50～60min；所述提取介质II由pH8.0的100mmol/L Tris HCl，20mmol/L EDTA，2％CTAB，1.4mol/LNaCl混合而成；(6)冷却至室温，加入反应体系等体积的氯仿/异戊醇抽提后，于0～4℃，12000r/min，离心8～10min；所述氯仿/异戊醇的体积比为24∶1；(7)将步骤(6)离心分离的水相转入另一离心管，加入水相体积1/10的CTAB/NaCl，轻轻混匀，再加入水相等体积的氯仿/异戊醇抽提；所述CTAB/NaCl是由100g/L CTAB，0.7mol/L NaCl组成；所述氯仿/异戊醇的体积比为24∶1；(8)在抽提后的水相中加入水相体积1/10、浓度为3mol/L的NaAc和水相体积2/3的异丙醇，摇匀后于 20℃放置2h～3h；弃去液相，沉淀用75％乙醇洗涤2～3次，去乙醇自然风干，得大黄DNA；然后用灭菌ddH2O溶解DNA，于0～4℃保存，或于 20℃下放置长期保存。