经血源性间充质干细胞分离培养及其免疫调节作用

摘要

本发明公开了一种经血源性间充质干细胞(ERCs)分离培养及其免疫调节作用。本发明采用密度梯度离心法从经血中成功分离出ERCs，并对其特异性表面标记及增殖活力进行了检测，建立了该细胞稳定的培养方法，由于来源广泛，取材方便，可以无创伤获取，不涉及伦理问题，为MSCs的临床应用提供了新的替代来源，具有良好的应用前景。同时，经研究还发现，ERCs及培养上清对同源及异源淋巴细胞都具有免疫调节作用，ERCs能显著降低人外周血淋巴细胞IFN-γ的分泌。表明ERCs免疫调节作用机制可能与细胞间的直接接触及抑制淋巴细胞IFN-γ的分泌有关，为减少异体移植引起的免疫排斥反应及治疗自身免疫系统疾病提供理论依据。

主权项

一种经血源性间充质干细胞分离培养，其特征在于：它包括下述步骤：第一步：培养基的配制每390ml DMEM高糖培养基加入100ml灭活后的胎牛血清、5ml 10000U/ml的青/链霉素及5ml 0.25mg/ml的两性霉素B，得到体积为500ml的培养基备用；第二步：经血源性间充质干细胞的分离与培养材料获取：取月经血5ml，加入0.2ml 0.25mg/ml的两性霉素B、0.2ml青/链霉素，0.1mlEDTA Na2防止病原微生物污染，在材料获取24 48h内进行下述细胞分离；细胞分离：在15ml离心管中缓慢加入5ml比重为1.077的淋巴细胞分离液，将经血与等量PBS缓冲液充分混匀后，用滴管沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液分层液面上，细胞悬液与分离液两者比例为1∶1或2∶1；2000rpm/min水平离心20min；离心后管内液体分为四层，上层为血浆和PBS缓冲液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层交界处有单核细胞层；用移液器吸取单核细胞层置入另一15ml离心管中，加入5倍以上体积的PBS缓冲液，1200rpm/min离心10min，洗涤两次；末次离心后，弃上清，用5ml培养基充分混匀后置于T25培养瓶中，于37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度培养箱卧式培养；换液：细胞培养三天后，将培养瓶取出，弃去其它类型杂细胞及未贴壁细胞，每3 4天全量换液1次；传代：待细胞达到80％～90％融合时，进行传代，贴壁细胞用PBS洗涤2次，再用含有0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的细胞消化液于37℃消化30秒到1分钟，消化过程中，用倒置显微镜观察细胞消化情况，待细胞大部分胞体回缩、变圆，即加入少量血清终止消化；然后加适量PBS缓冲液，用吸管反复吹打使细胞绝大部分脱落后，将细胞悬液移入15ml离心管，1000r/min，离心5min，弃去上清，后用培养基制成细胞悬液，充分混匀后按1∶3比例传代培养，记为P1代；传代培养过程中每3 4天全量换液一次，贴壁细胞再次融合铺满瓶底后，重复上述操作，记为P2代，以此类推。