鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺

摘要

本发明涉及一种鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺，实施步骤如下：(1)将鱼精多肽溶解在双蒸水中，取上清液；(2)上清液上样、收集组分、冻干得冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和分离纯化；(3)分离纯化、洗脱，然后以线形梯度为0-0.35M NaCl的20mM，pH8.3Tris-HCl缓冲液洗脱，收集冻干；(4)冻干粉溶解、脱盐柱处理，收集冻干；(5)最高活性组分通过分离柱分离纯化，用含0.1％三氟乙酸的3％乙腈洗脱，在280nm下检测，收集冻干；(6)最高活性组分通过反相柱分离、洗脱，收集冻干，用于测定自由基的清除活性和结构鉴定。其可明显清除羟自由基活性，而且有效降低MRC-5胞内自由基的含量，从而保护细胞避免氧化损伤。

主权项

一种鱼精多肽中的抗氧化二肽的分离纯化工艺，实施步骤如下：(1)取鱼精多肽，即鱼精蛋白酶解产物0.25 0.5g溶解在5 10ml双蒸水中，10000rpm离心8 10min，取上清液；(2)上清液上样到Sephadex G 35柱26×450mm，双蒸水以0.6ml/min流速洗柱；在254nm下监测流出样品，根据检测器的样品峰收集每个组分，视收集样品和出峰时间的时间差，且根据出峰时间再延期3 6秒收集；收集完成后，各收集管中样品合并，立即放在 80℃冷冻保存； 80℃下的样品迅速放入也预冷的冷冻干燥器中，冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；(3)将最高抗氧化活性的组分收集、冻干，过程与步骤(2)相同，进一步利用Macro Prep High Q柱16×150mm分离纯化，柱子先用20mMTris HCl缓冲液pH8.3、以0.8ml/min流速，预处理1h；上样后，柱子用20mMTris HCl缓冲液pH 8.3以0.8ml/min流速洗脱30min，然后以线形梯度为0 0.35M NaCl的Tris HCl缓冲液20mM，pH 8.3洗脱，洗脱曲线在254nm下检测；每个组分根据洗脱峰被收集、冷冻干燥；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；(4)冻干粉溶解成较高浓度，用5ml注射器上样，然后用5ml Hi Trap脱盐柱处理，在254nm检测，根据洗脱峰收集，收集冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；(5)最高自由基清除活性的多肽组分通过具有二级管阵列Waters 2695HPLC系统进一步分离纯化，分离柱为10×250mm、C4的反相柱YMC PackPROTEIN RP；用含0.1％三氟乙酸的3％乙腈洗脱，在280nm下检测，根据洗脱峰收集，手动收集样品，然后冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和进一步分离纯化；(6)活性组分被收集浓缩，最高活性组分进一步通过3.9×150mm的反相分离柱Symmetry ShieldTMRP18分离，用含0.1％三氟乙酸的线形梯度5 15％乙腈以0.8ml/min速度洗脱，在254nm下检测，根据洗脱峰收集，手动收集样品，然后冻干；冻干后得到冻干粉，双蒸水溶解成不同浓度用于测定自由基的清除活性和结构鉴定。