富集和纯化糖结合蛋白的方法

摘要

一种富集和纯化糖结合蛋白的方法，其糖与微纳米磁性微粒偶联是：活化偶联剂，将糖连接到氨基基团衍生化的微纳米磁性微粒上或环氧乙烷基团衍生化的微纳米磁性微粒上。对糖结合蛋白进行分离、富集和纯化是：加入连接有糖的微纳米磁性微粒和先预处理的糖结合蛋白进行结合反应，清洗、洗脱，得到富集纯化的糖结合蛋白。本发明解决了背景技术中方法复杂，使用不便，回收率较低的技术问题。本发明固定化糖的连接方式简单、快速，且成本较低。糖结合蛋白的生物活性稳定，对糖结合蛋白进行分离、富集和纯化的效率高。

主权项

一种富集和纯化糖结合蛋白的方法，其特征在于：该方法的实现步骤包括1)糖与微纳米磁性微粒偶联(1)偶联剂的活化：①按1∶5∶5的物质的量之比取偶联剂4 羟基苯基戊酸、N 羟基琥珀酰亚胺与二环己基碳二亚胺，分别溶解于有机溶剂中；所述的有机溶剂为乙酸乙酯或二甲基甲酰胺；②先将4 羟基苯基戊酸与N 羟基琥珀酰亚胺混合；再加入二环己基碳二亚胺混合；用有机溶剂溶到使三者浓度分别为20mM、100mM和100mM；所述的有机溶剂为乙酸乙酯或二甲基甲酰胺；③于摄氏35～40℃，温育8～16小时；(2)氨基基团衍生化的微纳米磁性微粒的预处理：取氨基基团衍生化的微纳米磁性微粒于离心管中，加入活化的4 羟基苯基戊酸溶液的上清，物质的比为1∶10；于摄氏35～40℃，温育4～6小时；(3)清洗：磁性分离，弃上清；用乙醇清洗3次，再用缓冲液清洗3次；所述的缓冲液为乙酸钠、碳酸钠、磷酸盐或Tris HCl；(4)偶联：加入2ml用偶联缓冲液配制的100mM的糖溶液，于摄氏35～40℃，温育8～16小时，糖被连接到氨基基团衍生化的微纳米磁性微粒上，得连接有糖的微纳米磁性微粒；所述的偶联缓冲液为乙酸钠、碳酸钠、磷酸盐或Tris HCl；(5)清洗：磁性分离、弃上清，用缓冲液清洗3次；所述的缓冲液为乙酸钠、碳酸钠、磷酸盐或Tris HCl；(6)保存：加入保存缓冲液，于2～6℃保存；所述的保存缓冲液为1mM CaCl2、1mM MnCl2、0.02％NaN3、10mM Tris HCl pH 6.0的缓冲液；2)对糖结合蛋白进行分离、富集和纯化(1)糖结合蛋白的预处理：用水配制10mg/ml的糖结合蛋白，用结合缓冲液稀释至0.5mg/ml；所述的结合缓冲液为1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris HCl pH 7.0的缓冲液；(2)结合反应：取连接有糖的微纳米磁性微粒于1号离心管中，加入0.5mg/ml的糖结合蛋白，于摄氏35～40℃反应1～3小时，磁性分离、弃上清液；(3)清洗：向1号离心管中加清洗缓冲液1清洗，磁性分离、弃上清液；重复清洗一次；所述清洗缓冲液1为1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris HCl pH 6.5的缓冲液；(4)清洗：向1号离心管中加清洗缓冲液2清洗，磁性分离、弃上清液；再重复清洗二次；所述清洗缓冲液2为1mM CaCl2、1mM MnCl2、10mM Tris HCl pH 6.5的缓冲液；(5)洗脱：向1号离心管中加清洗缓冲液3，清洗20～30分钟，磁性分离、取上清液于2号离心管中；再重复清洗一次，取上清液合并于2号离心管中，得到富集纯化的糖结合蛋白；所述的清洗缓冲液3为1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mM KCl、100mM α 甲基甘露糖、10mM Tris HCl pH7.0的缓冲液；(6)保存：向1号离心管中加保存缓冲液，于2～6℃保存。