利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法

摘要

本发明公开了一种利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法。本发明主要通过优化发酵培养基的配方、诱导前补料液的配方、诱导后补料液的配方、乳糖诱导液的配方以及发酵参数，成功运用乳糖替代IPTG作为诱导剂来诱导目的蛋白的表达。本发明的目的蛋白表达水平高，目的蛋白占菌体总蛋白的水平可达35～49％，与IPTG诱导水平相当。而且本发明在发酵过程中添加乳糖诱导后再补甘油作为碳源，既可大大提高生物量，又能减少代谢副产物乙酸的生成，还能避免由于发酵液中葡萄糖的存在而影响乳糖的诱导效果。可见，本发明不仅简便，发酵时间短，生产成本低，而且得到的产物中无毒害物质残留。

主权项

一种利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将已转化利用pMFH载体和目的基因构建得到的重组载体质粒的宿主菌进行活化，依次制备一级种子和二级种子；(2)发酵和诱导：将二级种子接种于发酵培养基中，在接种后2.5～4h开始慢速流加乳糖诱导前补料液，乳糖诱导前补料液体积与发酵罐工作体积之比为1/25～1/20，于1～2h流加完；当发酵罐内的pH值开始上升时流加乳糖诱导液进行诱导目的蛋白的表达，乳糖诱导液体积与发酵罐工作体积之比为1/25～1/20，1～2h补加完，加完诱导液后立即补加乳糖诱导后补料液，乳糖诱导后补料液体积与发酵罐工作体积之比为1/25～1/20，于2～3h内流加完，持续诱导6～8h，发酵罐中乳糖诱导终浓度为10～16g/L；发酵培养基的组成如下：葡萄糖2～8g/L、酵母提取物12～30g/L、胰蛋白胨8～24g/L、氯化钠2～6g/L、硫酸铵1～3g/L、磷酸氢二钠4～10g/L、磷酸二氢钾2～8g/L、柠檬酸0.5～2.4g/L、七水硫酸镁0.4～1.2g/L，微量元素溶液1ml/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/ml，初始pH 6.8～7.5；所说的微量元素溶液的组成为：FeSO4·7H2O 1.8～3.6g/L、MnCl2·4H2O 1.2～2.8g/L、Co(NO3)2·6H2O 2.0～4.0g/L、CaCl2·2H2O 1.0～2.0g/L、CuCl2·2H2O 0.1～0.3g/L、ZnSO4·7H2O 0.2～0.4g/L、H3BO3 0.6～1.8g/L和Na2MoO4·2H2O 1.0～3.0g/L溶于1mol/L HCl中，微量元素溶液过滤除菌；所述的诱导前补料液的组成为：葡萄糖225～450g/L、七水硫酸镁5～10g/L、氯化铵15～60g/L，用去离子水配制；所述的诱导后补料液的组成为：甘油150～450g/L、乳糖50～150g/L、七水硫酸镁5～10g/L，用去离子水配制；所述的乳糖诱导液的组成为：乳糖50～300g/L、酵母提取物50～300g/L、七水硫酸镁5～10g/L，用去离子水配制。