一种检测克隆特异性T淋巴细胞TCR BV CDR3基因组成的方法

摘要

一种检测克隆特异性T淋巴细胞TCR BV CDR3基因组成的方法，包括：抽提外周血单个核细胞或组织样本中总RNA并逆转录成cDNA。根据TCR BV基因设计TCR BV 24个家族上游引物和共同下游引物BC，染料法实时荧光定量PCR扩增cDNA。熔解曲线分析PCR产物，对PCR产物的荧光强度变化负一次导数(-dF/dT)与温度(Tm)间作图，获BV各家族峰形图，对只出现单峰的BV家族PCR产物纯化后作序列分析，测序结果与TCRβ链标准基因序列比对。根据单峰在BV各家族峰形图上出现情况判断克隆特异性T淋巴细胞在组织或外周血中的分布，结合测序结果确定克隆特异性TCR BV CDR3基因组成。本发明在评价与特异性克隆T细胞相关疾病中有着重要意义。

主权项

一种检测克隆特异性T淋巴细胞TCR BV CDR3基因组成的方法，其特征在于如下步骤：(1)制备抗凝的外周血待检样本，或采集待检组织样本；(2)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞PBMC，试剂盒抽提PBMC或待检组织中总RNA，并采用MBI公司逆转录试剂盒合成cDNA；(3)以T细胞受体TCR beta链可变区BV 24个家族的26条引物分别为上游引物，其中BV5，BV13二个家族各设有2条引物；在BC1、BC2区域设计共同下游引物BC，采用步骤(2)制备的逆转录产物cDNA为模板，染料法实时荧光定量PCR进行扩增；(4)熔解曲线分析cDNA的PCR产物，通过对PCR产物荧光强度变化负一次导数与温度间作图，得到BV各家族的峰形图，统称为基因熔解谱型图GMST，对在GMST上只出现单峰的BV家族的PCR产物纯化后进行序列测定；(5)根据测序结果，按DDBJ、GeneBank及IMGT库中TCR BV、BD、BJ、BC标准基因序列，进行序列比对，确定克隆特异性T细胞TCR BV CDR3基因组成。