一种分泌表达重组人角质细胞生长因子-2的制备方法

摘要

本发明提供了一种分泌表达重组人角质细胞生长因子-2的制备方法，该方法提供了一种重组人角质细胞生长因子-2的表达载体，它含有分泌信号肽编码序列，能将KGF-2蛋白分泌到细胞周质中进行表达，含有此重组质粒的宿主细胞经低温反复冻融，在不破坏细菌内膜的情况下即可使重组蛋白释放到缓冲液中，不破坏蛋白的活性。

主权项

1.一种分泌表达重组人角质细胞生长因子-2的制备方法，其特征在于，提供优化的表达人角质细胞生长因子-2的表达载体pET22b(+)，并将编码人角质细胞生长因子-2的DNA序列插入该表达载体pET22b(+)中，得到重组质粒pET22b(+)-rhKGF-2，所述表达载体pET22b(+)含有分泌信号肽编码序列，能将KGF-2蛋白分泌到细胞周质中表达；将转入pET22b(+)-rhKGF-2的大肠杆菌BL21(DE3)单克隆，接种到含50mlLB培养基的250ml三角烧瓶中，培养3～4hr，待OD₆₀₀达到0.8～1.0，按1∶10的比例接种于含250ml改良种子培养基的1000ml三角烧瓶中，培养8～10h，待OD₆₀₀达到6～8，按1∶10上罐发酵，流加甘油、镁盐、和氨水调节pH6.8～7.0，温度37℃、DO＞30％，待OD₆₀₀达到15～18，加入0.5～0.8mMIPTG开始诱导，补加甘油、氮源、磷酸盐缓冲液调节pH7.2～7.4、DO＞50％，温度30～32℃，诱导4～5hr结束；其中，LB培养基含1％蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl；改良种子培养基含1％酵母提取物、1％蛋白胨、0.3％K₂HPO₄、0.12％KH₂PO₄、0.4％NaCl、和0.5％葡萄糖；罐内培养基含2.3％蛋白胨、1.7％酵母提取物、0.3％K₂HPO₄、0.12％KH₂PO₄、0.4％(NH₄)Cl、0.1％MgSO₄、0.1％微量元素、和0.5％糖蜜；采用冻融破碎发酵菌体，低温高速离心弃沉淀，收上清；通过超滤对破菌液上清液进行初步纯化；和依次阳离子交换层析和亲和层析纯化。