发明名称 |
一种重组鸭α -干扰素的制备方法 |
摘要 |
本发明公开了一种重组鸭α-干扰素的制备方法,属于生物制药技术领域。该方法包括:(1)鸭α-干扰素基因合成;(2)引物的设计和合成;(3)表达载体的构建;(4)工程菌的诱导表达;(5)表达产物的提取、纯化、复性;(6)生物学活性测定等步骤组成。本发明重组鸭α-干扰素制剂纯度达90%以上,每毫升细胞半数保护量达105u以上,经临床应用其相对治愈率达93%以上,且其价格低廉,为鸭病毒性肝炎治疗提供了一种安全有效,无毒副作用的新药剂,具有良好的社会效益和应用前景。本发明可在鸭养殖场和禽用制药企业推广应用。 |
申请公布号 |
CN101899446A |
申请公布日期 |
2010.12.01 |
申请号 |
CN201010107059.2 |
申请日期 |
2010.02.08 |
申请人 |
浙江省农业科学院 |
发明人 |
张存;叶伟成;刘蔓雯;张燕 |
分类号 |
C12N15/21(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C07K14/56(2006.01)I;C07K1/14(2006.01)I |
主分类号 |
C12N15/21(2006.01)I |
代理机构 |
杭州丰禾专利事务所有限公司 33214 |
代理人 |
沈伾伾 |
主权项 |
1.一种重组鸭α-干扰素的制备方法,该方法按以下步骤进行:(1)鸭α-干扰素基因合成:将Genebank公布编号为X84764的鸭α-干扰素基因序列进行合成;(2)引物的设计和合成:根据鸭α-干扰素基因序列设计用于扩增鸭a-干扰素成熟蛋白基因的引物,该上、下游引物的5`端分别加上BamHI和EcoRI酶切位点,该引物对的序列为:上游引物P1:5`-ATTAGGATCCTGCAGCCCCCTGCGCCTC-3`下游引物P2:5`-GAAGAATTCTTAGCGCATGGTGCGGGTG-3`(3)表达载体的构建:以合成的鸭α-干扰素基因为模板,用P1、P2引物扩增出鸭a-干扰素成熟蛋白基因,经BamHI和EcoRI双酶切插入表达载体PET-28a(+)BamHI和EcoRI的酶切位点,再转化入受体菌E.coliBL21-plsS,筛选出高效表达的阳性克隆菌,经测序验证正确后作为工程菌保存;(4)工程菌的诱导表达:将阳性克隆菌接种含50ug/ml卡那的LB培养液,37℃培养过夜,次日将该菌液按2%的接种量接种与上述相同LB培养基中,37℃培养至OD<sub>600</sub>值为0.6~0.7;加入最终浓度为1mmol的IPTG诱导剂诱导培养4h;取菌液4000转离心10min收集菌体,置-70℃冰箱保存,备用;(5)表达产物的提取、纯化、复性:将菌体与由50mM磷酸缓冲液、300mMNaCl、10mMβ-巯基乙醇配制,pH7.8的裂解buffer按重量1∶4比例重悬;用高压均质机在650帕压力下,重复裂解两次,13000转、离心20分钟,得沉淀物即提取的包涵体;将包涵体与由6M盐酸胍、100mMNaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>、10mMTris-HCl、10mMβ-巯基乙醇配制,pH8.0的溶解buffer按重量1∶10比例用超声波重悬,室温下作用90min,10000转离心30min后,取上清液过镍柱纯化,得带有组氨酸标签的纯度达90%以上的目的蛋白;将纯化后的目的蛋白装入透析袋,先在由2M尿素、50mM醋酸缓冲液、10mMβ-巯基乙醇、50mMNaCl配制,pH3.6的缓冲液1中透析复性24小时,10000转离心10min,取上清液;再在由50mM醋酸缓冲液、50mMNaCl配制,pH3.6的缓冲液2中透析复性48小时,期间换液一次,过滤除菌后即为粗制鸭α-干扰素;(6)生物学活性的测定:采用微量细胞病变抑制法,在鸭胚成纤维细胞系上用水泡性口炎病毒VSV检测粗制重组鸭α-干扰素的生物学活性,其生物学活性为每毫升细胞半数保护量达10<sup>5</sup>u以上,即为重组鸭α-干扰素成品。 |
地址 |
310021 浙江省杭州市江干区石桥路198号 |