检测苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法

摘要

一种检测苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法，其特点是经耐3’→5’核酸外切酶酶切修饰的突变检测引物在高保真DNA聚合酶参与的PCR反应中，其产物特异性非常高，可直接观察凝胶电泳的产物条带的有无来判断PAH基因相应突变位点的基因型。本发明操作简单，经济，无需测序，一般分子生物学实验室就可操作；本发明建立的方法和荧光定量PCR技术结合，可实现生物样本临床检测的自动化以及高通量，大大提高检测准确性和效率。

主权项

1.一种检测苯丙酮尿症PAH基因七个热点突变位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括检测R111X、IVS-4-1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P七个热点突变位点的七组引物中的至少一组；第一组：所述检测R111X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：突变模板配对引物R111XM：5’-ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTCAA-3’；正常模板配对引物R111XN：5’-ACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTCGA-3’；共同上游或下游引物R111XC：5’-TGCCCCACCTCCTGCCACTT-3’；其中，所述突变模板配对引物R111XM和正常模板配对引物R111XN的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；第二组：所述检测IVS-4-1热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：突变模板配对引物IVS-4-1M：5’-CAGGTGTCTCTTTTCTCCTAAC-3’；正常模板配对引物IVS-4-1N：5’-CAGGTGTCTCTTTTCTCCTAGC-3’；共同上游或下游引物IVS-4-1C：5’-TTCCATCCTCAACTGGATGA-3’；其中，所述突变模板配对引物IVS-4-1M和正常模板配对引物IVS-4-1N的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；第三组：所述检测Y204C热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：突变模板配对引物Y204CM：5’-GTATAAAACCCATGCTTGCTGA-3’；正常模板配对引物Y204CN：5’-GTATAAAACCCATGCTTGCTAA-3’；共同上游或下游引物Y204CC：5’-CTGATGTGGACTTACTCTGCAGG-3’；其中，所述突变模板配对引物Y204CM和正常模板配对引物Y204CN的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；第四组：所述检测R243Q热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：突变模板配对引物R243QM：5’-GCACTGGTTTCCGCCTCCAT-3’；正常模板配对引物R243QN：5’-GCACTGGTTTCCGCCTCCGT-3’；共同上游或下游引物R243QC：5’-TGTGGACCAGCCAGCAATGAACC-CAAACCTCATTCTTGCAGCAGG-3’；其中，所述突变模板配对引物R243QM和正常模板配对引物R243QN的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；第五组：所述检测W326X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：突变模板配对引物W326XM：5’-CTTTCCATTCCAGATTTACTAC-3’；正常模板配对引物W326XN：5’-CTTTCCATTCCAGATTTACTGC-3’；共同上游或下游引物W326XC：5’-GAAGGTCATACCTGTAATTCACCA-3’；其中，所述突变模板配对引物W326XM和正常模板配对引物W326XN的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；第六组：所述检测Y356X热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：突变模板配对引物Y356XM：5’-AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCATA-3’；正常模板配对引物Y356XN：5’-AGCTTTGGCTTCTCTGATAAGCAGA-3’；共同上游或下游引物Y356XC：5’-CTGTGATGTAGAAGGAATCGGGGTG-3’；其中，所述突变模板配对引物Y356XM和正常模板配对引物Y356XN的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰；第七组：所述检测R413P热点突变位点的引物的碱基序列如下所示：突变模板配对引物R413PM：5’-TACCTCGGCCCTTCTCAGTTCCG-3’；正常模板配对引物R413PN：5’-TACCTCGGCCCTTCTCAGTTCGG-3’；共同上游或下游引物R413PC：5’-AACATGGCAGTGACAGACCAAGT-3’；其中，所述突变模板配对引物R413PM和正常模板配对引物R413PN的3’端的-3，-2位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰或者3’端的-2位碱基经锁核酸化(LNA)修饰。