猪蓝耳病病毒实时荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种猪蓝耳病病毒实时荧光定量PCR检测方法，属于生物工程技术领域。本发明方法包括标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备以及有效性验证及结果检测判定步骤；其中特异性引物的正向引物的序列为：5’-GGGGGATGTCATCACGTTAC-3’，反向引物的序列为：5’-CGTCAATGTGCAAACTGCTT-3’；所述荧光探针的序列为：5’-FAM-CGCGCTTCCTTCCCAAGGAATC-TAMRA-3’。本发明检测灵敏度高，检测时间短，可同时进行大批量的样本分析，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，适用于病毒感染的前期诊断。

主权项

1.猪蓝耳病病毒实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于标准质粒的构建、特异性引物及荧光探针的设计、实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线、感染病毒样本的RNA提取及cDNA的制备、有效性验证及结果检测判定；(1)标准质粒的构建：在美国国立生物信息中心NCBI基因库Genbank中检索获得猪蓝耳病病毒的保守基因，基因片段从11271～11387，序列为：GGGGGATGTCATCACGTTACCTCCAAATACCTTCCGCGCTTCCTTCCCAAGGAATCAGTTGCGGTGGTCGGGGTTTCGAGCCCCGGGAAAGCCGCGAAAGCAGTTTGCACATTGACG；利用基因克隆技术构建含有该保守序列的标准质粒分子，所用的标准质粒为PUC57，由金斯瑞公司提供合成；(2)特异性引物及荧光探针的设计：正向引物PrimerF：5’-GGGGGATGTCATCACGTTAC-3’，反向引物PrimerR：5’-CGTCAATGTGCAAACTGCTT-3’；荧光探针的序列：5’-FAM-CGCGCTTCCTTCCCAAGGAATC-TAMRA-3’；(3)实时荧光定量PCR扩增及建立检测标准曲线，步骤为：(a)模板的制备：定量标准质粒为2.94×10⁹拷贝/μl，用稀释液将标准质粒稀释，即稀释成浓度分别为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴拷贝/μl的标准液，标准液在-20℃条件下保存备用；(b)实时荧光定量PCR扩增：25μl的PCR反应体系含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCRbuffer，2.5μl；10mMdNTPs，0.5μl；1.25UTaqDNA聚合酶，0.25μl；300nMPrimerF，2.5μl；300nMPrimerR，2.5μl；模板，1μl；将加样后的PCR试剂管放入荧光PCR仪中进行扩增，反应循环程序为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性20s、55℃退火30s、72℃延伸30s，40个循环后，得到反应产物；(c)建立检测标准曲线：荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件自动生成以起始模板数对数为x轴，C_T值为y轴的标准曲线；(4)有效性验证及结果检测判定，步骤为：(a)利用未感染猪蓝耳病病毒PRRS猪的cDNA配制阴性对照PCR反应体系：25μl的阴性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCRbuffer，2.5μl；10mMdNTPs，0.5μl；1.25UTaqDNA聚合酶，0.25μl；300nMPrimerF，2.5μl；300nMPrimerR，2.5μl；未感染PRRS猪的cDNA，1μl；利用感染PRRS猪的cDNA制备阳性对照PCR反应体系：25μl的阳性对照PCR反应体系为含有成分如下：DEPC水，15.75μl；10×PCRbuffer，2.5μl；10mMdNTPs，0.5μl；1.25UTaqDNA聚合酶，0.25μl；300nMPrimerF，2.5μl；300nMPrimerR，2.5μl；感染PRRS猪的cDNA，1μl；(b)循环反应：将加好样的阴性对照和阳性对照的PCR试剂管同时放入荧光PCR仪中，进行扩增，反应循环程序为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性20s、55℃退火30s、72℃延伸30s，40个循环后反应结束，得到反应产物；(c)有效性验证：荧光PCR仪采集荧光信号，经计算机软件生成阴性对照点和阳性对照点；阴性对照点应无C_T值并且无扩增曲线，阳性对照点应位于标准曲线上，并且其C_T值应＜32，否则重做。