主权项 |
一种蛇足石杉组织培养的方法,其特征在于包括以下步骤:(1)选择外植体从野外采集蛇足石杉[Huperzia serrata(Thunb.)Trev.]的孢子体,切取茎尖,经自来水冲洗干净;(2)杀灭表面菌将洗净的茎尖在超净台中先浸入浓度70%的乙醇溶液30‑50s;接着置于浓度0.1%的升汞(HgCl2)溶液浸泡7‑10min,再转入浓度7%的双氧水(H2O2)溶液中浸泡10‑15min,最后用无菌水冲洗3‑5次,作为蛇足石杉组织培养的外植体;(3)接种培养将所述外植体接种在促进茎尖生长的改良MS培养基上,置于22‑27℃、光照时间12‑14h/d、光照强度800‑2000lx条件下进行培养2‑3周;(4)杀灭内生菌将接种培养后的外植体转至含孔雀石绿和抗生素AAS的改良MS培养基上,继续培养2‑3周,培养条件同步骤(3);对内生菌进行杀灭。(5)扩繁培养将步骤(4)经内生菌杀灭后无菌的外植体转入丛生芽分化扩繁的改良MS培养基继续培养一段时间,当茎尖顶芽长到5‑8mm后,切取新长出的外植体顶芽约3‑5mm转接到丛生芽分化扩繁的改良MS培养基中进行组培苗的分化和增殖培养,培养条件同步骤(3),从组培苗茎基部分化产生出丛生苗;(6)生根培养切取步骤(5)中从组培苗茎基部分化产生的丛生苗转至生根培养基中,置于培养室进行生根培养,培养条件同步骤(3);所述改良MS培养基由下列物质组成:950mg/L硝酸钾(KNO3)、825mg/L硝酸铵(NH4NO3)、185mg/L硫酸镁(MgSO4·7H2O)、220mg/L氯化钙(CaCl2·2H2O)、85mg/L磷酸二氢钾(KH2PO4)、8.45mg/L硫酸锰(MnSO4·H2O)、4.3mg/L硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、3.1mg/L硼酸(H3BO3)、0.415mg/L碘化钾(KI)、0.125mg/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、0.025mg/L硫酸铜(CuSO4·5H2O)、0.025mg/L氯化钴(CoCl2·6H2O)、50mg/L肌醇、1mg/L甘氨酸、0.5mg/L盐酸吡哆醇(VB6)、0.5mg/L烟酸(VB5)、0.1mg/L盐酸硫胺素(VB1)、9.31mg/L乙二胺四乙酸二钠(Na2‑EDTA·2H2O)、6.96mg/L硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、30g/L蔗糖、5.6g/L琼脂;所述含孔雀石绿和抗生素AAS的改良MS培养基由下列物质组成:在改良MS培养基中加入100mg/L抗生素(AAS)和0.5mg/L孔雀石绿;所述丛生芽分化扩繁的改良MS培养基由下列物质组成:在改良MS培养基中加入2μmol/L 6‑苄氨基嘌呤(6‑BA);所述生根培养基由下列物质组成:在改良MS培养基中加入10μmol/L 3‑吲哚丁酸(IBA)。 |