一种食品中鸡蛋过敏原卵清蛋白的酶联免疫检测方法

摘要

一种食品中鸡蛋过敏原卵清蛋白的酶联免疫检测方法，属于免疫分析技术领域。本发明应用高纯度的卵清蛋白免疫健康的新西兰大白兔得到多克隆抗体，以该抗体作为检测试剂，高纯度卵清蛋白为标准品和包被抗原，建立了食品中卵清蛋白的间接ELISA方法。本发明为在食品中卵清蛋白的含量检测提供了快速高效的检测手段，由于采用的是多克隆抗体，费用较低并且稳定性和重复性较好，灵敏度为1ppm，线性范围为1-128ppm，免疫反应的高特异性和亲和性使ELISA具有极高的选择性和灵敏度。

主权项

一种食品中鸡蛋过敏原卵清蛋白含量的酶联免疫检测方法，其特征在于(1)抗原的包被用高纯度卵清蛋白作为包被抗原，以包被缓冲液pH 9.6、0.05M的碳酸钠缓冲液CBS稀释包被抗原，包被抗原浓度为0.125～256μg/mL作为包被液，在酶标板的每孔中加入100μL包被液，4℃孵育过夜，用含0.1％明胶的包被缓冲液作为封闭液封闭；封闭液为含0.1％明胶的pH 9.6、0.05M的CBS；(2)竞争反应将高纯度卵清蛋白免疫制备的卵清蛋白多克隆抗体用抗体稀释液PBST按1∶4000重量比稀释后，加入酶标板中，每孔加50μL，同时分别加入用标准品稀释液稀释的系列浓度0.125μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1.0μg/mL，2.0μg/mL，4.0μg/mL，8.0μg/mL，16μg/mL，32μg/mL，64μg/mL，128μg/mL，256μg/mL的高纯度卵清蛋白标准品，每孔50μL，37℃孵育1h后以PBST洗涤液洗涤4次；抗体稀释液PBST为含1％明胶、含0.5％吐温‑20、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液；PBST洗涤液的配方为1000mL蒸馏水中加入氯化钠8g、磷酸二氢钾0.2g、磷酸氢二钠2.9g、氯化钾0.2g、吐温‑200.5mL；标准品稀释液的配方为在含30％体积甲醇的pH 6.5的PBS中加入质量浓度为5％的氯化钠；(3)加酶标二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔HRP‑IgG以抗体稀释液PBST稀释为1∶3000，每孔加100μL，37℃温育1h后以PBST洗涤液洗涤4次；(4)显色每孔加入100μL显色液，暗处37℃反应15min，取出后每孔加入100μL终止液2mol/L的硫酸，用酶标仪测定吸光值OD450；显色液包括A液和B液，A液配方为每100mL水中加入0.933g柠檬酸，3.68g Na2HPO4·12H2O，18μL30％H2O2；B液配方为60mg四甲基联苯胺溶于100mL乙二醇；使用时按A∶B＝5∶1体积比使用。