利用双热灭活亲本通过原生质体融合构建酵母菌株的方法

摘要

本发明公开了一种利用双热灭活亲本通过原生质体融合构建酵母菌株的方法，属于生物技术制菌领域。该方法是利用产色酵母和产酒酵母种属的差异，利用双热灭活亲本并用原生质体融合的方式，使双亲本原生质体融合而再生，获得同时具有来源于不同亲本的产色产酒的融合子菌株。其工艺步骤包括两亲本菌体和两亲本原生质体的制备；两亲本原生质体融合；融合子的检出与挑选和融合子发酵性能测试及复筛。本发明方法操作简单，过程易实现，育种成功几率高；其获得的酵母融合菌株，对于酒精发酵及色素积累过程的代谢调控理论研究及提高酒精发酵生产的管理控制效率都具有积极意义；同时也为酒精工业及色素生产的菌种选育提供了新的途径。

主权项

一种利用双热灭活亲本通过原生质体融合构建酵母菌株的方法，其特征在于依次包括以下工艺步骤：(1)两亲本菌体的制备分别将具有产乙醇和产色素能力的两亲本酵母细胞接种于酵母膏蛋白胨葡萄糖琼脂培养基即YPD固体培养基斜面上，待生长时间18～24小时后，刮取斜面上生长的酵母细胞，制得细胞浓度为107～109个/mL的菌悬液，吸取200μL菌悬液，接种于经115～125℃和15～25分钟灭菌的YPD液体培养基的瓶中，置于28～32℃的恒温摇床中培养10～18小时，制得两亲本菌体；(2)两亲本原生质体的制备将步骤(1)的两亲本菌体培养液以浓度为0.4～0.9mol/LNaCl离心洗涤三次，再将洗涤的菌体细胞稀释到浓度为106～107个/mL，取10mL稀释后的菌悬液，用4℃冷冻离心机离心2～4分钟，再加入5mL浓度为8～12mg/mL的蜗牛酶液酶解，轻摇使离心后的菌体和酶液充分混合，再置于温度28～32℃、转速150～200r/min的恒温摇床中，酶解90～150分钟；然后将酶解后的酵母细胞悬液置于4℃冷冻离心机中用0.4～0.9mol/LNaCl溶液洗涤两次，离心洗涤条件为2200r/min、4分钟，再将其悬于5mL，0.4～0.9mol/LNaCl溶液中，即制得两亲本原生质体；(3)两亲本原生质体融合于65～95℃下分别对产酒酵母和产色酵母的原生质体灭活15～45分钟后，将两亲本原生质体悬液在离心管中等量混合，于4℃冷冻离心机中2200r/min离心4分钟，然后加入配比为20～40％PEG6000、0.01mol/L CaCl2、0.4～0.9mol/LNaCl的融合剂，混匀后放入恒温培养箱中，25～35℃保温，静置30～45分钟以待融合；取出融合后酵母原生质体悬液，放入冷冻离心机中，在2200r/min、4分钟条件下用0.4～0.9mol/LNaCl溶液离心洗涤两次，以将融合剂洗净，将洗涤后的原生质体重悬于0.4～0.9mol/LNaCl溶液中，得到融合后的原生质体；(4)融合子的检出与挑选对融合后的原生质体进行初次筛选，先将其接种于具有再生培养基的平皿中，培养24～48小时，生长出融合子菌落；从生长的融合子菌落中挑选出菌落颜色接近粉红色的菌落；然后用划线分离法纯化挑选出融合子菌株，再将纯化后的融合子菌株接种于固体YPD培养基斜面，25～32℃培养，培养24h后，每隔约8～12h观察一次，挑选出具显著酒香味的斜面菌株，进行再次划线分离纯化，通过传代培养，以获得具有明显酒香味的稳定的融合子菌株，以试管斜面保存；(5)融合子发酵性能测试及复筛将初筛的融合子，通过杜氏管发酵实验对融合子的发酵能力强弱进行测定，实验时每支试管装115～125℃、15～25分钟灭菌的YPD液体培养基10mL，其中每支试管分别接入一接种环相应菌种，每3h观察1次，记录杜氏管中气泡产生情况，选出产生气泡多的融合子，即发酵性能好的融合子；分别将发酵性能好的融合子斜面菌苔2-3环接种于115～125℃、15～25分钟灭菌的麦芽汁发酵培养基中，25～32℃恒温振荡培养发酵3～7天，待发酵液有明显酒味后，取样常压蒸馏，并用酒精计测定蒸馏液的酒精度数，选出产乙醇能力强的融合子菌株。