淫羊藿苷单克隆抗体及其制备方法与应用

摘要

淫羊藿苷单克隆抗体及其制备方法与应用，涉及一种淫羊藿苷单克隆抗体。合成人工抗原ICA-BSA；小鼠免疫；细胞融合与杂交瘤筛选；杂交瘤细胞的量产、纯化及其鉴定；单抗的性质鉴定。利用杂交瘤技术制备淫羊藿苷的单克隆抗体，建立淫羊藿苷的酶联免疫吸附检测技术，以便对淫羊藿中药及其中成药内的淫羊藿苷含量进行检测和评价。研究结果表明，利用所建立ICA的单克隆抗体技术平台测定淫羊藿中药的ICA含量具有切实的技术可行性。此外，淫羊藿苷单克隆抗体还可以应用于淫羊藿苷的亲和层析柱分离纯化、中药复方的药理研究等方面。

主权项

淫羊藿苷单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)合成人工抗原ICA-BSA(1)将ICA溶于80％MeOH溶液，将NaIO4溶于50％MeOH溶液，把ICA溶液加入到NaIO4溶液中，混匀，遮光搅拌；(2)将BSA溶于0.05mol/L CB缓冲液，然后加入到ICA-NaIO4反应溶液中，混匀，用NaHCO3溶液将pH调节至9.0，遮光搅拌6h；(3)加入NaBH4，遮光搅拌；(4)将反应溶液经0.01mol/L PBS缓冲液透析，再用蒸馏水透析后，冻干，制得合成产物即为人工抗原ICA-BSA；2)小鼠免疫初次免疫使用弗氏完全佐剂与免疫人工抗原混合乳化，每只小鼠注射100μL，之后每隔2周继续加强免疫小鼠，加强免疫4～5次，待小鼠血清的抗体效价合适，则行脾脏注射进行冲击免疫方式，且3天后进行对小鼠断颈处死、取脾脏细胞进行融合操作；3)细胞融合与杂交瘤筛选使用PEG 1450介导免疫脾细胞与SP2/0融合，骨髓瘤细胞与脾细胞的数目比例为1∶(5～10)，置CO2培养箱中培养，采用有限稀释法筛选、分离目标单克隆杂交瘤，通过添加含HAT的RPMI 1640完全培养液，将阳性单克隆孔的杂交瘤依次转移至24孔细胞培养板、6孔细胞培养板和10cm培养皿，同时以ELISA方法鉴别、确保扩增的杂交瘤能够持续分泌抗体；将阳性孔杂交瘤细胞转移至24孔细胞板培养，使用添加HAT的RPMI 1640完全培养液，恢复杂交瘤细胞的快速增殖能力，挑取阳性孔重复有限稀释培养，最终获得具备稳定增殖能力，大量分泌特异性抗体的单克隆细胞株；4)杂交瘤细胞的量产、纯化及其鉴定采用腹水制备的方法，生产单克隆抗体的杂交瘤细胞和目的抗体，采用6～8周龄的Bulb/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡后一周注射1.0mL/只杂交瘤细胞悬浮液；再引颈处死小鼠，收集腹水，离心0.45μm微孔滤膜过滤，并采用Protein G亲和层析柱纯化目的抗体，透析、冻干样品；取冻干抗体样品和未纯化腹水跑SDS-PAGE凝胶电泳，测定纯度及分子量，同时也利用MALDI-TOF-MS法测定单抗的分子量，以互为应证；5)单抗的性质鉴定对获得的淫羊藿单抗的性质进行交叉反应率、敏感度和亲和力等的测定；(1)ICA-MAb的交叉反应率采用竞争ELISA法测定单抗的交叉反应率，对若干与淫羊藿苷分子结构类似的黄酮类化合物葛根素，槲皮素，芦丁，大黄酸，大豆苷元，黄芩苷，黄芩素与淫羊藿苷的可能发生的交叉反应率进行了测定并比较；(2)ICA-MAb的抗体敏感度绘制抑制率-ICA标准品浓度对数的标准曲线，以抑制率达到50％时所对应的ICA浓度为单抗的灵敏度；(3)ICA-MAb的抗体亲和力亲和常数通过间接竞争ELISA法测定。