多基因聚合辅助载体pCR35STnos的构建方法及其应用

摘要

本发明涉及多基因聚合辅助载体pCR35STnos的构建方法及其应用。辅助载体pCR35STnos的技术特征是含有“5′-X-启动子-MCS-终止子-Y-X-3′”表达盒，其中X与Y互为同尾酶，MCS为多克隆位点。辅助载体pCR35STnos的应用特征是首先将各目的基因分别亚克隆到该辅助载体的MCS上，获得相应基因表达盒。然后用同尾酶X酶切辅助载体获得基因表达盒1，并重组到带有基因表达盒2的辅助载体的Y同尾酶酶切位点上，获得含有两个基因表达盒的辅助载体。同理可以将多个基因表达盒聚合到该辅助载体上。最后用X或其它限制性内切酶酶切下多基因表达盒，重组到表达载体中，获得多基因表达载体。

主权项

一种多基因聚合辅助载体pCR35STnos的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)首先设计合成5′-AGCTTCTAGAGCTCAGGATCCGAATTCCTAGGTCTAGAGGGCC-3′和5′-CTCTAGACCTAGGAATTCGGATCCTGAGCTCTAGA-3′两个单链DNA片段；(2)经变性退火获得5′末端为HindIII粘性末端、3′末端为ApaI粘性末端、中间依次为XbaI、SacI、EcoRI、BlnI、XbaI限制性内切酶酶切位点的多克隆位点序列；(3)利用HindIII和ApaI限制性内切酶酶切位点，将步骤(2)获得的多克隆位点序列重组到invitrogen质粒pCR2.1-TOPO上，获得重组质粒，命名为pCRMCS；(4)SacI与EcoRI酶切载体pCB302-1，获得CamV 35S启动子，与同样经过SacI与EcoRI酶切后的pCRMCS重组，得到约4.8kb过渡载体，命名为pCR35S；(5)再以载体pCB302-1为模板，以5′-TACTCGAGGCTCGAATTTCCCCGATC-3′与5′-AACGACGGCCAGTGAATT-3′为引物扩增出300bp的Tnos终止子，将Tnos终止子克隆到pGEM-T Easy载体上，经测序验证后，经EcoRI进行酶切回收，与同样经过EcoRI酶切并去磷酸化的pCR35S连接，获得含有“-XbaI-P35S-MCS-Tnos-BlnI-XbaI-”结构片段的5.1kb辅助载体，命名为pCR35STnos，其中MCS为多克隆位点序列，上面的酶切位点依次为SphI、PstI、SalI、BamHI、SmaI、XhoI和EcoRI。