一种鉴别羊肉和鸭肉的PCR-RFLP方法

摘要

羊肉和鸭肉鉴别的PCR-RFLP方法属于分子生物学检测领域。它设计了一种羊肉制品肉种来源鉴别的方法，解决了目前羊肉和鸭肉鉴别方法准确性低的缺陷，提供了鉴别羊肉和鸭肉的PCR-RFLP检测技术。可将羊肉和鸭肉按以下方法加以鉴别：提取样品DNA，采用通用引物扩增和凝胶电泳检测，然后分别用Bsu36I和SpeI限制性内切酶进行PCR-RFLP分析，即可区分羊肉和鸭肉。本发明采用PCR-RFLP方法，具有简单、快捷、廉价和准确性高的特点。

主权项

一种鉴别羊肉和鸭肉的PCR-RFLP方法，其特征在于可将羊肉和鸭肉按以下方法加以鉴别：一、将取50mg待检样品放入1.5mL的EP管(EP管应高压灭菌)中，用小剪刀将其剪碎。二、加入STE抽提液600μL、ProK(20mg/mL)20μL及20％的SDS溶液15μL，在震荡器上充分混匀。三、将EP管置入水浴锅，55℃消化过夜(12-16h)，在此期间可取出颠倒混匀几次，以便消化彻底。四、将EP管取出，每管加入600μL的Tris饱和酚，轻轻摇动混匀15min，然后在12000rpm离心10min。五、转移上清液至新的EP管，加入等体积的酚氯仿异戊醇混合液(酚∶氯仿∶异戊醇体积比为25∶24∶1)，颠倒混匀10min，然后12000rpm离心10min。六、转移上清液至新的EP管，加入等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿∶异戊醇体积比为24∶1)，轻轻混匀10min，然后在12000rpm离心10min。七、转移上清液至新的EP管，先加入1mL冰乙醇，再加入60μL的NaAc(3M)，轻轻水平摇动，可见絮状、白色DNA出现。将EP管放入-20℃冰箱冷冻30min，然后在12000rpm离心10min，可见DNA沉于管底。弃无水乙醇，再用75％的乙醇洗涤DNA两次，然后在12000rpm离心10min；自然干燥后，加入50μL TE溶液溶解。八、PCR扩增及检测：引物用可扩增所有脊椎动物Cyt b序列的通用上游引物F：5’-TAC CAT GAG GAC AAA TAT CAT TCT G-3’和通用下游引物R：5’-CCT CCT AGT TTG TTA GGG ATT GAT CG-3’。PCR反应总体积为25μL，其中10×PCR Buffer 2.5μL，Taq DNA聚合酶0.2μL(2.5U/μL)，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，10pmol/μL的上、下游引物各2μL，模板DNA 250ng，灭菌蒸馏水补足总体积。扩增条件为：95℃变性10min，95℃变性45s，53℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环后在72℃继续延伸7min。取4μL的PCR产物与1μL的6×loadding buffer混合，采用TAE缓冲系统，2％琼脂糖凝胶(加入染色剂Gold view I)在5v/cm恒压电泳条件下约25min，在凝胶成像系统中观察并记录。九、Bsu36I酶切分析：对步骤八中的PCR产物用限制性内切酶Bsu36I进行PCR-RFLP分析；Bsu36I只能将鸭的PCR产物切割为95bp和377bp的片段，而不能切割山羊和绵羊的PCR产物，根据琼脂糖凝胶检测结果是否可检测到95bp和377bp的条带来判断是否为鸭肉。十、SpeI酶切分析：对步骤八中的PCR产物用限制性内切酶SpeI进行PCR-RFLP分析；SpeI可将绵羊和山羊的PCR产物切割为326bp和146bp，但不能切割鸭的PCR产物，根据琼脂糖凝胶检测结果是否可检测到326bp和146bp的条带来判断是否为羊肉。