发明名称 |
黄鳝凝血酶的制备工艺及应用 |
摘要 |
本发明是一种黄鳝凝血酶的制备工艺,其特征在于,在黄鳝泄殖孔后剪去其尾部,得黄鳝血液,经干燥获得黄鳝全血干粉;取黄鳝全血干粉,经离心得到上清液,再将上清液透析得样液;然后洗脱分离样液中的凝血酶,根据蛋白质层析系统配套软件显示的的分离峰,分别收集3个分离峰,并依次命名为MAB-I,MAB-II和MAB-III;分离峰经凝血酶活性检测得到具有凝血活性的黄鳝凝血酶MAB-II。本发明选用黄鳝血液作为研究对象,在黄鳝血液的制备时选用剪尾取血方法;在分离选用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂;本发明方法可有效地排除了其他带有阳离子的蛋白质,提高了纯化效率,所得的黄鳝凝血酶具有较佳的凝血活性。 |
申请公布号 |
CN101376882B |
申请公布日期 |
2010.10.27 |
申请号 |
CN200810156837.X |
申请日期 |
2008.09.27 |
申请人 |
淮海工学院 |
发明人 |
李联泰;安贤惠;浦寅芳 |
分类号 |
C12N9/74(2006.01)I;A61P7/04(2006.01)I |
主分类号 |
C12N9/74(2006.01)I |
代理机构 |
南京众联专利代理有限公司 32206 |
代理人 |
刘喜莲 |
主权项 |
一种黄鳝凝血酶的制备工艺,其特征在于,其步骤如下,(1)取血:黄鳝放入水中排除体内杂物后,在黄鳝泄殖孔后0.9-1.1cm处剪去其尾部,将血液流滴于培养皿中,得黄鳝血液,培养皿中黄鳝血液的厚度1.5-2.0mm;(2)干燥:将上述盛有血液的培养皿用纱布遮盖并置于室温自然风干,获黄鳝全血干粉;(3)样液制备:称取0.5g黄鳝全血干粉,用10mL 0.05mol/L、pH 7.0的Tris-HCl缓冲液充分溶解,于4℃、8000rpm离心20min,取上清液;用移液器将10mL上清液移入截留分子量为3500的透析袋中,透析袋放入盛有800mL 0.05mol/L、pH 7.0的Tris-HCl缓冲液的容器中,在4℃下透析6h,中间换水2-3次,得样液;(4)分离:选用DEAE Sepharose Fast Flow填料,加入适量0.05mol/L、pH 7.0的Tris-HCl缓冲液,用玻璃棒搅拌并将其引流到1.5cm×12cm层析柱中,胶体积11mL,连接Biologic Duoflow蛋白质层析系统,选用A:0.05mol/L、pH 7.0的Tris-HCl和B:含NaCl 0.5mol/L的0.05mol/L、pH 7.0的Tris-HCl两种洗脱液,设定流速1.50mL/min,且洗脱过程中当A280大于0.03时开始收集,每管收集1.5mL;按下述程序洗脱分离样液中的凝血酶:①洗脱液A平衡2个柱体积;②走基线;③自动进样液5mL;④洗脱液A洗脱2个柱体积;⑤洗脱液B洗脱4个柱体积;⑥洗脱液B洗脱2个柱体积;⑦洗脱液A洗脱2个柱体积;根据Biologic Duoflow蛋白质层析系统配套软件显示的的分离峰,分别收集3个分离峰,并依次命名为MAB-I,MAB-II和MAB-III;即得MAB-I,MAB-II和MAB-III 3种样品;(5)分离峰的凝血酶活性检测:在离心管中加入3.8%柠檬酸钠溶液2mL,然后向离心管中加入鸡血至20mL处,保持柠檬酸钠的终浓度为0.38%,于4℃、8000rpm离心20min,上清液即为鸡血浆;凝血酶活性检测反应体系为:在试管中加1mL鸡血浆,100μL步骤(4)所得的样品,混匀,再加入60μL、0.4mol/L的CaCl2,检测得到具有凝血活性的黄鳝凝血酶MAB-II。 |
地址 |
222006 江苏省连云港市新浦区苍梧路57号海洋学院安贤惠转 |