一种离褶伞菌液体菌种的培养方法

摘要

本发明是一种离褶伞菌液体菌种规模化生产方法。将野外收集的离褶伞菌(Lyophyllum Karst)子实体通过组织分离方法获得纯菌株，再纯化得到离褶伞母种，使用固化和液体培养基制备母种，使用液体培养基按照液体菌种培养方法进行离褶伞菌丝体的发酵培养，规模化生产离褶伞原种和栽培种。具有成本低、易实现、可广泛地应用于离褶伞的大规模人工生产中。本发明中所提供的培养基和液体菌种生产方法，特别适合云南离褶伞菌的菌种制备与菌丝体的规模化液体发酵培养，利用该培养基和生产方法，可快速进行云南离褶伞菌丝体发酵培养，实现离褶伞自然资源的可持续利用。

主权项

一种离褶伞菌液体菌种规模化生产方法，其特征在于按以下步骤进行：(1)将野外收集的离褶伞菌通过组织和孢子分离方法获得纯菌株；(2)将野外获得的纯菌株经过纯化、多代选择，得到在固化培养基上生长速度稳定、苔面菌丝浓密粗壮、生长快速，在液体培养基内生长快速、菌丝体呈明显的絮棉状或者碎屑状的离褶伞菌母种；(3)配制扩大母种：A、母种液体摇瓶种子培养：将分离纯化的离褶伞菌纯菌株挑取米粒大小的5-10块接入装有150-300mL母种液体培养基的摇瓶中进行液体母种培养，培养条件：旋转式摇床80-200转/分钟，培养温度为15-25℃，培养10-20天成为成熟液体母种；B、固化母种扩繁培养：将分离纯化的离褶伞纯菌株挑取米粒大小的3-5块转接入含有母种固化培养基的三角瓶上，接种块间距2厘米左右，在15-25℃条件下培养20天左右菌落基本相连接即成为成熟固化母种；所述液体培养基由葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，维生素B150mg，蛋白胨2g，酵母膏2g，水1000mL组成，pH自然；母种固化培养基是在上述液体培养基中添加琼脂15-20g配制而成；(4)原种液体摇瓶种子培养：A、在500mL摇瓶中装入150-300mL液体培养基，0.14MPa高压蒸汽灭菌20-30分钟，待冷却到室温后，严格无菌操作按液体培养基体积百分比5-10％的接种量接入成熟液体母种进行液体原种培养，培养条件：旋转式摇床80-200转/分钟，培养温度为15-25℃，培养10-20天成为成熟液体原种；B、在500mL摇瓶中装入150-300mL原种液体培养基，0.14MPa高压蒸汽灭菌20-30分钟，待冷却到室温后，严格按无菌操作程序，将经过高速分散器分散后的成熟固化母种接种到摇瓶中，接种量为每250mL三角瓶的成熟固化母种分散后接种3-5瓶500mL摇瓶，接种后进行原种液体摇瓶种子培养，培养条件：旋转式摇床80-200转/分钟，培养温度为15-25℃，培养10-20天成为成熟液体原种；原种液体培养基组成为：糖类25g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，蛋白胨2g，酵母粉2g，水1000mL组成，pH自然；(5)栽培种发酵罐培养：以发酵培养基体积百分比5-10％的接种量把成熟液体原种接入装有100-150升无菌发酵培养基的总容积为200升的种子罐进行液体栽培种培养，培养条件为：培养温度15-25℃，通气量1∶0.4-0.8V/V·min，搅拌速度60-160转/分钟，保持罐压0.03-0.10MPa，经过10-15天通气培养，达到对数生长期即可得到离褶伞菌液体菌种；栽培种发酵培养基组成为：淀粉30g，蔗糖20g，葡萄糖10g，酵母粉10g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，水1000mL组成，pH自然。