大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质研究

摘要

以大肠杆菌基因组DNA为模板，扩增得到编码苹果酸脱氢酶(MDH)的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上，在E.coliBL21(DE3)中用IPTG诱导表达，利用表达载体pET-28a上的6·His-Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的苹果酸脱氢酶(MDH)。粗酶的比酶活为43U/mg，纯化后比酶活达到112.5U/mg，纯化倍数达2.62倍，回收率为59％。并对该酶的酶学性质进行了初步研究，其中反应最适pH值为6.0，在pH值2.0-6.0的酸性范围内稳定，反应最适温度为37℃，在42℃以下酶的稳定性较好。k+对酶有明显的激活作用，Ni2+、Co2+、Fe3+对酶稍有激活作用。Cu2+、Zn2+对酶有明显的抑制作用。Hg2+对酶有很强的抑制作用，酶活基本没有。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235mmol/L，Vmax为0.47umol/L.min。酶学性质的研究为MDH的应用打下了良好的理论基础。

主权项

构建重组质粒pET-28a-mdh，其特征是以大肠杆菌基因组DNA为模板，扩增得到编码苹果酸脱氢酶(MDH)的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-mdh。(1)mdh基因的克隆根据mdh基因的特异性设计引物用该引物特定条件下扩增mdh基因得到939bp的特异型条带。(2)重组质粒pET-28a-mdh转化大肠杆菌BL21(DE3)根据权利要求1所述方法得到重组质粒pET-28a-mdh转化大肠杆菌BL21(DE3)；其特征是将含mdh基因的重组质粒pET-28a-mdh通过转化大肠杆菌感受态细胞转入大肠杆菌BL21(DE3)中，在含卡那霉素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，得到重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a-mdh。