一种制备原生质体的方法

摘要

本发明公开了一种进行高效制备植物悬浮细胞原生质体的方法。该方法包括以下步骤：(1)用0.5-1M的甘露醇溶液处理植物细胞，然后收集细胞；(2)用酶解液酶解步骤(1)收集的细胞；(3)在经过步骤(2)处理的体系中加入A溶液，除去未酶解的细胞凝块后进行离心处理，收集沉淀，即得到原生质体；所述A溶液为水溶液，溶质为如下终浓度的物质：100-200mM NaCl，100-150mM CaCl2，2-10mM KCl，5-10mM葡萄糖，1-3mM脂肪酸甲酯磺酸钠；所述A溶液的pH为5.5-5.8。该方法主要适用于BY2悬浮细胞和拟南芥悬浮细胞原生质体的制备。用本发明的方法分离的悬浮细胞原生质体得率高，细胞生长状态好，结合PEG介导的瞬时转化可满足对目的基因进行细胞学定位，免疫共沉淀，Western杂交等多种研究目的。

主权项

一种制备植物原生质体的方法，包括以下步骤：(1)用0.5-1M的甘露醇溶液处理植物细胞，然后收集细胞；(2)用酶解液酶解步骤(1)收集的细胞；所述酶解液为水溶液，溶质为如下终浓度的物质：质量百分含量为1％-2％的纤维素酶；质量百分含量为0.2％-0.5％的离析酶；1-3mg/ml的脂肪酸甲酯磺酸钠；1-5mg/ml的牛血清白蛋白；400-500mM甘露醇；1-5mM CaCl2；所述酶解液的pH值为5.5-5.8；(3)在经过步骤(2)处理的体系中加入A溶液，除去未酶解的细胞凝块后进行离心处理，收集沉淀，即得到植物原生质体；所述A溶液为水溶液，溶质为如下终浓度的物质：100-200mM NaCl，100-150mM CaCl2，2-10mM KCl，5-10mM葡萄糖，1-3mM脂肪酸甲酯磺酸钠；所述A溶液的pH值为5.5-5.8；所述步骤1)中处理植物细胞的温度为23-28℃，时间为10-20min；所述步骤2)中所述酶解的温度为23-28℃，酶解的时间为3-5小时。