富硒灵芝中硒蛋白的制备方法

摘要

富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，它涉及一种蛋白质的制备方法。本发明解决了现有方法得到的硒蛋白纯度低的问题。方法：一、超滤、硫酸铵沉淀制备富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白；二、富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白和Tris–HCl缓冲液混合，过滤；三、用葡聚糖凝胶柱进行分离纯化；四、用阴离子交换层析柱进行分离纯化；五、用疏水层析柱进行分离纯化即得到富硒灵芝中的硒蛋白。本发明制备得到硒蛋白中硒含量为6mg/g左右，与现有方法制备得到的硒蛋白相比较，本发明方法制备得到的硒蛋白中硒含量高，同时采用凝胶过滤法检验本实施方式制备得到的硒蛋白的纯度，洗脱曲线呈现单一蛋白峰，本发明制备得到的硒蛋白纯度好。

主权项

富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于富硒灵芝中硒蛋白的制备方法按照以下步骤进行：一、10~15g的富硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在0~10℃的条件下搅拌7~10小时，然后抽滤得到滤液A，用去离子水清洗抽滤后的残渣得到滤液B，将滤液A和滤液B混合得到混合液，再向混合液中加入醋酸至pH为4.0~4.5，而后加入占混合液质量百分比为20%~30%的硫酸铵，在3~5℃的条件下静置10~14小时，而后在4500~5500r/min的条件下离心15~25min去沉淀，然后向离心上清液中加入占离心上清液质量百分比为70%~90%的硫酸铵，在3~5℃的条件下静置10~14小时，而后在4500~5500r/min的条件下离心15~25min，将离心后的沉淀加入100~200 mL浓度为0.05mol/L、pH 为8.0的 Tris–HCl缓冲液混合，再经过孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤后，滤液用截留分子量为3000的膜进行超滤过滤，重复超滤过滤4~6次得到蛋白质溶液，蛋白质溶液再经真空冷冻干燥，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白；二、1~10mg的富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白和1mL的浓度为0.05mol/L、pH 为8.0的 Tris–HCl缓冲液混合，然后在11000~13000g的条件下离心20~30min，离心后的上清液经孔径为0.22μm的膜过滤得到滤液；三、将2mL步骤二得到的滤液放入到葡聚糖凝胶柱中，在流速为1 mL/min、检测波长为280 nm的条件下进行洗脱，洗脱液是浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris–HCl缓冲液，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅰ；四、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅰ加入到阴离子交换层析柱中，然后在流速为1mL/min、检测波长为280nm的条件下进行线形梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅱ；五、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅱ加入到疏水层析柱中，在流速为0.5~1.5mL/min、检测波长为280 nm的条件下进行线性梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝中的硒蛋白。