RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方法

摘要

本发明涉及生物医学领域中病毒检测微阵列芯片的方法，具体为一种RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方法。其特点是：以待检测病毒核酸序列为模板设计特异性检测探针，检测探针按两部分进行化学合成。如果“靶”病毒存在，则其检测探针的两部分可通过T4DNA连接酶连接。连接后的检测探针与固定在芯片上的其相应的捕获探针杂交，以连接后的检测探针为模板，以捕获探针为引物，进行在片DNA多聚酶聚合(包括Cy3-dUTP)反应产生荧光信号。如果“靶”病毒不存在，则无荧光信号产生。该方法检测的灵敏性比ELISA高十倍，检测的最小稀释浓度为万分之一(10□4，感染提取液/无感染提取液)。以病毒基因组为信息载体设计特异性检测探针、以基于靶RNA(所检病毒RNA)为模板的检测探针的连接、芯片杂交和在片DNA聚合酶延伸标记反应等实验，建立一种操作方便的病毒检测芯片方法。

主权项

RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方法，其特征在于：该检测方法包括如下步骤：由ICTV和GenBank中获得病毒基因组全序列，推断其保守性区域，用DNAStar、DNAMan和Primer Primier 5.0软件，设计长度44-50bp异性检测探针；检测探针是部分1和部分2合成，其部分1的3′端为羟基、连接处的5′端磷酸化，部分1的3′端和5′端均为羟基，捕获探针(capture probe，CP)序列与检测探针的部分1序列互补；所有捕获探针的5′端修饰NH2(amino modifier C6)、3′端为羟基。固定在固体基片表面固定，捕获探针既可作为在片聚合延伸的引物也可作为杂交探针用以捕获已连接的检测探针；将化学合成的单链捕获探针通过微点样技术转移到化学修饰的玻片表面，借助其5′端氨基连接到玻片表面，制备成捕获探针微阵列；以提取的由一种或两种以上病毒感染病株的靶RNA为连接模板(template)，用T4连接酶连接检测探针；连接完成后，进行变性，加入RNase III降解、去除RNA；用含有已连接检测探针及dUTP-Cy3、dATP、dCTP、dGTP的聚合酶反应混合物与制备的微阵列杂交，并进行在片延伸标记反应。