一种同时提取堆肥中总DNA和RNA的方法

摘要

本发明具体公开了一种同时提取堆肥中总DNA和RNA的方法：首先向堆肥样品中添加去腐缓冲液，振荡混匀，静置，悬浮液进行离心分离；重复本操作至离心后的上清液澄清；用液氮研磨脱腐后的样品至粉状，然后置于裂解液中振荡混匀，再冰浴，离心分离；取裂解后的上清液，加入醋酸钠和抽提缓冲液，振荡后离心分离；取抽提后的上层水相加入氯仿-异戊醇，振荡后离心分离；再加入异丙醇沉淀RNA，经洗涤、干燥、溶解后得到纯化的RNA；取抽提后的有机相加入Tris碱溶液，取离心后的上层水相加入氯仿-异戊醇，离心分离后再加入醋酸钠和无水乙醇沉淀DNA，经洗涤、溶解后得到纯化的DNA。本发明的方法具有产量大、质量好、成本低等优点。

主权项

一种同时提取堆肥中总DNA和RNA的方法，包括以下步骤：(1)样品的脱腐：先向待提取DNA和RNA的堆肥样品中以8～12ml/g堆肥样品的用量添加预冷的去腐缓冲液，振荡混匀，冰上静置数秒；然后将静置后的悬浮液进行离心分离，弃上清液；重复本步骤直至离心后的上清液澄清透明；(2)样品的裂解：用液氮研磨上述脱腐后的样品至粉状，然后将粉状样品添加至裂解液中，涡旋振荡混匀，再冰浴使其充分裂解，并进行离心分离；(3)核酸的抽提：取上述裂解步骤后得到的上清液，加入体积为该上清液的0.05～0.2倍的醋酸钠溶液，混合后再加入与该上清液等体积的水饱和苯酚-氯仿-异戊醇组成的抽提缓冲液，涡旋振荡后置于冰上5～10min，再进行离心分离；(4)RNA的分离与纯化：取上述核酸抽提后得到的上层水相，向其中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，涡旋振荡混匀后进行离心分离；再取该离心分离后的上层水相，向其中加入等体积冰预冷的异丙醇，于-20℃～-10℃静置20～30min沉淀RNA，再进行离心分离；弃上清，用乙醇溶液洗涤沉淀，再进行离心分离；弃上清，在空气中干燥去除残余的乙醇，经过焦碳酸二乙酯处理水溶解、分装后即得到纯化的RNA溶液；(5)DNA的分离与纯化：取上述核酸抽提后得到的有机相，向该有机相中加入等体积的Tris碱溶液反相抽提DNA，混匀后离心分离；取离心后的上层水相，并向其中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀后离心分离，回收水相，加入0.05～0.2倍体积的醋酸钠溶液和1.5～2.5倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃～-10℃静置20～30min沉淀DNA，再进行离心分离；去上清后用乙醇溶液洗DNA沉淀，再用含RNase的TE缓冲液溶解得到纯化的DNA溶液。