一种提取芹菜中CELⅠ核酸酶的方法

摘要

本发明方法抛弃了现有方法中的多次高速或超速离心以及多次凝胶过滤和离子交换层析的手段，在抽提液中采用添加少量亚硫酸钠减少和清除提取液中有色物质；采用热变性的物理方法，快速清除大量耐温性差的杂蛋白；利用CEL I是糖蛋白能与活化的刀豆凝集素结合的特点，使CEL I核酸酶与刀豆凝集素结合除去其他杂蛋白，使CEL I得到进一步的的纯化；最后选择DEAE-Sepharose FF作为适宜介质进行一次层析纯化出CEL I。这样，我们的提取方法代替现采用多次高速甚至超速冷冻离心、多次凝胶过滤和离子交换层析等费时且昂贵的手段，达到快速将CEL I核酸酶从芹菜中提取出来并纯化的目的。

主权项

一种提取芹菜中CEL I核酸酶的方法，该方法由以下步骤组成：(1)称取芹菜，每1kg芹菜加入80～120ml缓冲液A，捣成匀浆，压榨出液体，过滤，用1M的Tris溶液调节pH至8.0，得粗酶液；(2)将粗酶液在45～50℃下保温15～20min，然后3000×g～5000×g离心20～40min，取上清液；(3)加入硫酸铵粉末至饱和度为25％，3000×g～5000×g离心20～40min，收集上清液；所得上清液中加入硫酸铵粉末至饱和度为80％，3000×g～5000×g离心20～40min，收集沉淀物；(4)将所得沉淀物用缓冲液B溶解，透析脱盐；(5)加入刀豆凝集素，混匀，4～10℃下搅拌6～16小时使CEL I核酸酶与刀豆凝集素充分结合，然后静置20～60min；(6)抽滤去清液，在滤渣中加入缓冲液C溶解出CEL I核酸酶，超滤浓缩；在4～10℃条件下，上DEAE-Sepharose FF，然后依次用洗脱液D和洗脱液E各500ml以0.5～1ml/min的流速进行梯度洗脱；(7)收集洗脱液，用RF-I Nicking方法检测各收集管中的CEL-I核酸酶活力，合并酶活力在3×107U/mg蛋白的洗脱液；上述步骤中，所述缓冲液A由以下方法制备得到：在pH8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液中添加Na2SO3和苯甲基磺酰氟至浓度分别为0.01M和1mM；所述缓冲液B由以下方法制备得到：在pH8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液中添加苯甲基磺酰氟至浓度为1mM；所述缓冲液C由以下方法制备得到：在pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液中添加甲基甘露糖苷和Triton X-100至浓度分别为30mM和0.01％；所述洗脱液D由以下方法制备得到：在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中添加甲基甘露糖苷、Triton X-100和KCl至浓度分别为10mM、0.01％和10mM；所述洗脱液E由以下方法制备得到：在pH8.0的Tris-HCl缓冲液中添加甲基甘露糖苷、TritonX-100和KCl至浓度分别为10mM、0.01％和0.5M。