不结球白菜GLDH基因提高乌塌菜Vc含量的应用

摘要

本发明涉及不结球白菜GLDH基因提高乌塌菜Vc含量的应用，属于分子生物学和生物技术领域。利用RT-PCR技术获得了GLDH基因完整编码区序列，进一步构建其植物过量表达载体，导入农杆菌LBA4404。优化含培养基配方及操作流程等技术方案，建立了乌塌菜转基因遗传转化体系。采用农杆菌介导法将植物过量表达载体转化乌塌菜。通过卡那霉素抗性筛选获得转基因植株，运用PCR技术进行目的基因整合乌塌菜基因组的鉴定。本发明验证了该基因在Vc合成途径中的重要作用，成功获得过量表达GLDH的转基因植株，与非转基因植株相比，转基因植株的GLDH基因表达量最高为对照的28.5倍，植株Vc含量最高为对照的1.8倍。为以后通过基因工程提高蔬菜品质提供了理论依据和实践经验。

主权项

不结球白菜GLDH基因提高乌塌菜Vc含量的应用，其特征在于：1)植物过量表达载体的构建根据不结球白菜L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶基因GLDH的cDNA序列，基因登录号：AY899298，设计扩增其完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点XbaI和SmaI，设计引物为：S1：5′-GCTCTAGACGCCTGAACTAAAACAAAAATGC-3′   XbaIA1：5′-TCCCCCGGGCGGCTTCACTCTTCTTACAAACACT-3′SmaI以不结球白菜‘苏州青’叶片总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用ExTaq酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃3min；94℃1min，45℃1.5min，72℃3min，5个循环；94℃45s，64.4℃1min，72℃2.5min，30个循环；72℃10min；4℃保存，扩增得到1938bp的GLDH基因cDNA经回收纯化克隆至克隆载体PMD18-T中，利用引物S1和A1引入的XbaI和SmaI酶切位点进一步克隆至植物表达载体pCAMBIA2301，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确，得到植物过量表达载体质粒pCAMBIA2301-GLDH；2)植物表达载体质粒pCAMBIA2301-GLDH转化农杆菌植物过量表达载体pCAMBIA2301-GLDH加入到感受态农杆菌，混匀后冰浴30min，随后液氮速冻1.5min，迅速移至37℃水浴5-6min，加入1mL新鲜的YEB液体培养基，于28℃，250rpm振荡培养4h，然后4℃，12000rpm离心6min，弃去大部分上清液，再加入200μL YEB液体培养基后悬浮菌液，涂布于含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEB固体培养基，28℃暗培养2-3d直到平板上长出单菌落，PCR鉴定后获得携带有载体pCAMBIA2301-GLDH的农杆菌LBA4404；3)农杆菌介导法转化乌塌菜①农杆菌侵染液的准备分别挑取携带有植物过量表达载体pCAMBIA2301-GLDH的农杆菌LBA4404单菌落，接种于含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的5mL YEB液体培养基中，于28℃，200rpm振荡过夜，次日取500μL菌液转化到50mL新鲜的含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEB液体培养基中，于28℃，200rpm振荡过夜，至菌液OD600为0.5-0.6，将菌液4000rpm离心10min，弃上清液，用pH 5.2的MS液体培养基重新悬浮并稀释至50mL，加乙酰丁香酮至终浓度100μmol/L，28℃，200rpm振荡4h后用于外植体侵染转化；②外植体的预培养，侵染和共培养乌塌菜种子用70％酒精消毒1min，再用质量体积比0.1％HgCl2处理18min，无菌水冲洗4次，种子在无菌滤纸上吸干水分后接种于1/2MS培养基，培养条件为光照12h，光强2000-3000lx，温度25℃，4-5d后待子叶完全展开，切取乌塌菜带柄子叶作为外植体插入预培养基中，培养条件同上，将经过2-3d预培养的带柄子叶从培养基取出置于制备好的农杆菌侵染菌液中振荡侵染5min，用无菌滤纸吸去多余的农杆菌液，另取一张灭菌滤纸平铺于共培养基上，用MS液体培养基浸湿，将侵染好的带柄子叶置于其上共培养，于25℃暗培养24-36h；③不定芽再生，筛选和植株形成将共培养后的带柄子叶用灭菌蒸馏水冲洗4次后用灭菌滤纸吸干水分，移至分化培养基，25d后取外植体上分化出的不定芽转接到筛选培养基进行2-3次的卡那霉素筛选培养，把存活的抗性苗转入继代培养基中以扩繁植株和恢复生长，最后经过生根培养直至产生完整的再生植株，移栽后按实生苗植株正常管理，获得T0代植株；所用培养基配方如下：预处理培养基：MS+0.1mg/L 2，4-D+1mg/L NAA+0.8％琼脂pH 5.8；共培养基：MS+0.1mg/L 2，4-D+2mg/L 6BA+100μmol/L乙酰丁香酮+0.8％琼脂pH 5.2；分化培养基：MN+4mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+5mg/LAgNO3+500mg/L羧苄青霉素+0.9％琼脂pH 5.8；筛选培养基：MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+500mg/L羧苄青霉素+50mg/L卡那霉素+0.8％琼脂pH5.8；继代培养基：MS+0.5mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+0.5mg/L KT+0.8％琼脂pH5.8；生根培养基：B5+0.2mg/L NAA+0.7％琼脂pH5.8，MN培养基为MS培养基中的NH4+减半；④转甚因植株的获得和PCR鉴定T0代植株提取基因组DNA，所用引物为：GUS-F：5′-ACGTCCTGTAGAAACCCCAACC-3′GUS-R：5′-TCCCGGCAATAACATACGGCGT-3′PCR检测结果呈阳性的植株即为乌塌菜转基因植株。