一种细胞蚀斑快速滴定狂犬病病毒的方法

摘要

本发明提供一种细胞蚀斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其包括以下步骤：(1)配置甲基纤维素溶液；(2)制得细胞悬液；(3)稀释待测定的狂犬病毒液，得到梯度浓度狂犬病病毒液；(4)将所述的细胞悬液加入细胞培养板中；(5)将所述梯度浓度狂犬病病毒液加入到步骤(4)中得到的细胞培养板中，同时设置阴性对照，置于CO2培养箱中培养；(6)弃去细胞培养板中的上清液，将甲基纤维素溶液加至培养孔中，置于CO2培养箱继续培养；(7)结晶紫染色，观察细胞培养板的各培养孔的蚀斑数；(8)计算毒价。该滴定方法操作简单，快速准确，可控性强、批间误差小，缩短了狂犬病病毒毒价的检验周期。

主权项

一种细胞蚀斑快速滴定狂犬病病毒的方法，其特征是：其包括以下步骤：(1)、将已灭菌的甲基纤维素与维持液按照1∶99～2∶98的质量比混合，2℃～8℃放置使甲基纤维素充分溶解，得到质量百分比浓度为1％～2％的甲基纤维素溶液，作为覆盖层；(2)、消化处于对数生长期的BHK-21细胞，用生长液稀释处于对数生长期的BHK-21细胞，使细胞密度为1×105个/毫升～5×105个/毫升，得到BHK-21细胞悬液；(3)、用维持液104～108倍系列稀释待测定的狂犬病病毒液，得到梯度浓度狂犬病病毒液；(4)、将所述细胞悬液按0.9ml/孔加入到细胞培养板中；(5)、将所述梯度浓度狂犬病病毒液按0.1ml/孔加入到步骤(4)中得到的含有细胞悬液的细胞培养板中，同时设置阴性对照，置于CO2培养箱中培养；(6)、6～12h细胞贴壁后，弃去所述细胞培养板中的上清液，用摩尔浓度为0.01mol/L、pH值为7.2～7.4的灭菌磷酸盐缓冲液冲洗，直到死细胞完全脱落；然后每孔加入步骤(1)所配制的质量百分比浓度为1％～2％的甲基纤维素覆盖培养基1ml～2ml，作为覆盖层，置于CO2培养箱中继续培养；(7)、72～96h后弃去覆盖层，并用摩尔浓度为0.01mol/L、pH值为7.2～7.4的灭菌磷酸盐缓冲液冲洗，直至将甲基纤维素冲洗干净；然后每孔加入200μl～2ml、0.5％～1.5％质量百分比的结晶紫溶液，室温染色15～20min后，用自来水缓缓冲洗，直至染色液冲洗干净，晾干，观察细胞培养板的各培养孔的蚀斑数；(8)、阴性对照无蚀斑出现的细胞培养板，判为有效板，根据有效板的各培养孔的蚀斑数、接种的待测定的狂犬病病毒液的用量及稀释倍数计算出待测定的狂犬病病毒液的毒价。