带有阳离子识别基团的蛋白质印迹树脂的制备方法及应用

摘要

带有阳离子识别基团的蛋白质印迹树脂制备方法及在蛋白质分离中的应用。蛋白质印迹树脂制备包括，合成辅助识别链、对载体进行修饰、合成蛋白质印迹树脂。采用聚乙烯醇作为辅助识别链的骨架，识别基团确定为氨基，而用于负载辅助识别链的载体选用进行过双键修饰的80-100目的聚乙烯醇微球载体。为了增加蛋白质印迹聚合物的特异性，将识别基团在短链上所占的比例定为10％-8％。模版蛋白质使用克隆的猪亲环素18蛋白质。本发明克服了通常由单体制备的识别体系识别位点单一、结构紧密蛋白质不易洗脱的弊端。同时成球与印迹分步进行，避免了对模板蛋白质的破坏，实用性强。使用克隆的蛋白质作为模板，克服了印迹天然微量蛋白质时模板无法得到的瓶颈。

主权项

一种带有阳离子识别基团的蛋白质印迹树脂的制备方法，其特征是该方法的制备步骤如下：第一、合成辅助识别聚合物链：以二甲基亚砜为溶剂，以N，N-二异丙基碳二亚胺及1-羟基苯并三唑为缩合剂，使得聚合度在40-50的短链聚乙烯醇上10％-8％的羟基与芴甲氧羰酰基保护的甘氨酸进行接枝反应，聚乙烯醇与两种缩合剂以及芴甲氧羰酰基保护的甘氨酸的比例为：每克聚乙烯醇，使用1mLN，N-二异丙基碳二亚胺，2g 1-羟基苯并三唑，8g芴甲氧羰酰基保护的甘氨酸；之后，加入体积比为1∶1的吡啶与丙烯酰氯的混合物，使得聚乙烯醇上另外10％-8％的羟基与丙烯酰氯发生接枝反应，然后将反应溶液用10倍体积的乙醇沉淀，离心，并且用乙醚洗去乙醇，真空干燥24小时，然后将所得产物溶于50ml体积比为1∶1的二甲基亚砜与DMF混合溶剂中之后，再加入哌啶脱去甘氨酸上的保护，用乙醇沉淀，离心，干燥，即得到辅助识别聚合物链；第二、对载体进行修饰：取80-100目的聚乙烯醇微球10g在二甲基亚砜中溶胀后，加入10ml吡啶及10ml丙烯酰氯，30℃下反应4h，使得微球上的羟基接枝上丙烯酰基，之后用乙醇洗涤并过渡到水相中，即得双键修饰后的聚乙烯醇微球载体；第三、合成蛋白质印迹树脂：在pH＝7.1磷酸盐缓冲溶液中，摩尔比为300∶1的辅助识别聚合物链与克隆的猪亲环素18蛋白质于4℃进行自组装8小时，之后往溶液中加入的湿的经过双键修饰的聚乙烯醇微球载体吸附16小时，湿的经过双键修饰的聚乙烯醇微球载体与克隆的猪亲环素18蛋白质的质量比为1000∶3；随后加入质量比为29∶1的丙烯酰胺及N，N-亚甲基双丙烯酰胺混合溶液、过二硫酸铵溶液，室温通氮除氧1h，然后加入N，N，N′，N′-四甲基二乙胺，交联聚合反应2小时，用500mM KCl溶液洗涤树脂球至电泳检测无猪亲环素18蛋白质条带，得到蛋白质印迹树脂。