甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉的甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒。本发明根据GeneBank中公布的Influenza A Viruse(H1N1)virus 2009年北美变异株M基因、HA基因序列和Influenza A Viruse(H3N2)流行株的HA基因序列，通过序列比对寻找高度保守的区域，设计特异性引物和TaqMan探针，研制检测方法中的关键试剂——探针、引物和阳性对照(构建甲型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒基因重组克隆质粒)，经各反应条件的优化和特异性、敏感性和重复性试验，建立了甲型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法，一次试验即可同时特异性地检测甲型流感病毒、H1N1亚型流感病毒和H3N2亚型流感病毒。

主权项

一种甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选取适当的M基因、HA基因相关序列，设计特异性检测A型流感病毒、H1N1和H3N2亚型流感病毒的特异性引物及Tagman荧光探针，具体的核苷酸序列如下：A型流感病毒：P1  5’-CCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGAT-3’             P2  5’-GCTGCAGTCCTCGCTCACT-3’             Probe Fam-5’-TCTGTTCACGCTCACCGTGCC-3’-EclipseA型流感病毒H1N1亚型：             P15’-CCCCATTGCATTTGGGTAAA-3’             P25’-TGGAGAGTGATTCACACTCTGGAT-3’             Probe Hex-5’-TAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGA-3’-EclipseA型流感病毒H3N2亚型：             P15’-CTGGATCCTGTGGATTTCCTTT-3’             P25’-TGATGAACCCCAGCAAAACA-3’             Probe Rox-5’-CATATCATGCTTTTTGCTTTGTG-3’-Eclipse；(2)取被检样品提取病毒RNA；(3)建立荧光RT-PCR反应体系，将上述引物、探针以及各反应组份置于荧光PCR仪中，加入被检样品提取的RNA模板，进行反转录和扩增，反转录和扩增在荧光PCR仪内一次完成；(4)结果分析，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果。