猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR鉴别检测试剂盒及其生产方法

摘要

本发明设计一种猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR鉴别检测试剂盒及其生产方法。本发明针对该猪瘟病毒基因组5′端非编码区的137位存在一个A/G SNP位点设计了野毒株特异的MGB探针，并在两端保守区设计了一套通用引物，经过反转录酶浓度、DNA聚合酶浓度、上下游引物浓度和探针浓度的进一步优化，建立了CSFV TaqMan-MGB PCR鉴别检测方法。灵敏度试验结果显示，该方法与RT-nPCR符合率为94.3％，且灵敏度比RT-nPCR敏感10倍；特异性试验结果显示，17个CSFV质控株检测均为阳性，HCLV株和12个非CSFV病原检出率均为零，说明该方法具有很强的CSFV特异性。该方法仅能检测猪瘟病毒野毒株，而不能检测疫苗株和其它非猪瘟病毒株。从反应时间和试验成本等方面都体现了TaqMan-MGB PCR鉴别检测CSFV的优越性。

主权项

一种猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR鉴别检测试剂盒，其特征在于该试剂盒是由试剂、对照品、水和PCR反应管所组成：1)阳性对照：采用猪瘟石门标准毒株特异克隆其非编码区约300bp的片段体外逆转录获得，浓度为0.126～0.368μg/10μL；2)阴性对照：采用无特异性病原猪扁桃体或颌下淋巴结、肠系膜淋巴结，按1∶5倍体积加入磷酸盐缓冲液，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，然后3000r/min离心10min，取上清液转入离心管中备用；3)Trizol裂解液：40mL/瓶，分装至棕色瓶中，4℃存放备用；4)TaqMan-MGB PCR反应液：每个反应包括10×PCR缓冲液5μL、2.5μM dNTP混合物1.6μL、10μM MGB-F 3μL、10μM MGB-R 3μL，共12.6μL，50个反应共计630μL，分装成2管；MGB-F和MGB-R为本发明人设计、由专业公司合成的引物MGB-F：CATGCCCACA GTAGGACTAG CAAAMGB-R：GAACTACTGA CGACTGTCCT GTACTCA；5)反应酶：每个反应包括SSIIITM反转录酶0.3μL、Taq HS DNA聚合酶0.5μL，共0.8μL，50个反应共计45μL，分装成1管；6)探针溶液：按本发明所设计并由专业公司合成的探针MGB-P：5’-FAM-CTAGCCGTAG TGGCGA-MGB-3’，由5’-FAM和-MGB-3’修饰，合成的探针用0.1％焦磷酸二乙酯水稀释成5μM，每个反应需1.6μL，50个反应共计90μL，分装成1管，-20℃冻存备用。